水稻CRISPR/CAS9体系构建及OsPIDa基因功能研究
发布时间：2025-03-14 23:06
水稻有着悠久的种植历史,也是目前世界上食用人数最多的粮食作物之一。随着人口的增加,如何保障粮食稳产增产关系到国计民生,因此如何提高水稻的单位面积产量一直是水稻遗传学家和育种家致力解决的重大课题。随着基因组测序的完成和功能基因组学研究的广泛开展,越来越多的分子生物学手段被用于遗传育种领域。水稻遗传资源的挖掘一直是遗传和育种工作者关注的焦点问题。为了更加高效快速准确地创制水稻遗传资源,新的突变体创制方法不断被用于水稻。其中最近几年兴起的CRISPR/CAS9基因编辑技术成功地在多种生物中实现了高效快速的基因打靶。本研究开发了一套适用于水稻的CRISPR/CAS9基因编辑技术,并且在此基础上通过不同的方法扩展了该技术在水稻中的广适用性,满足了水稻中不同类型基因编辑的需求。小花作为承载水稻种子的核心器官,其发育的好坏直接决定了水稻产量的高低,因此小花的发育一直是水稻研究领域的热点。生长素在植物的各个生长发育时期均有重要的作用,但是目前生长素对小花发育的影响却知之甚少。PID(PINOID)基因在拟南芥中主要调控生长素的运输和信号传导。本研究以水稻中OsPIDa为研究对象,通过序列分析,基因克隆,...
【文章页数】：226 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 水稻CRISPR/CAS9技术构建
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 植物突变体构建方法的研究进展
1.2.1 随机诱变
1.2.1.1 物理诱变
1.2.1.2 化学诱变
1.2.1.3 DNA标签插入诱变
1.2.2 定点诱变
1.2.2.1 ZFN的原理及构建方法
1.2.2.2 TALEN原理及构建方法
1.2.2.3 CRISPR/CAS原理及构建方法
1.3 CRISPR/CAS9技术目前的研究进展
1.3.1 提高CRISPR/Cas9系统的生产力
1.3.1.1 针对CAS9进行密码子的优化
1.3.1.2 提高CRISPR/CAS9基因编辑特异性和效率
1.3.1.3 提高CRISPR/CAS9基因编辑后突变的遗传稳定性
1.3.1.4 使用CRISPR/CAS9进行多基因编辑
1.3.2 提高CRISPR/Cas9系统的质量控制
1.3.2.1 CRISPR/Cas9基因组编辑突变的检测
1.3.2.2 筛选稳定遗传株系
1.3.2.3 时空特异性基因编辑
1.3.2.4 提高CRISPR/CAS9基因编辑系统的精确性
1.3.2.5 获取不带有转基因片段的突变株系
1.4 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 水稻诱导型CRISPR/CAS9骨架载体的构建
2.2 水稻高效CRISPR/CAS9基因编辑骨架载体的构建
2.3 构建单sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体
2.4 通过两步酶切连接构建双sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体
2.5 通过一步酶切连接构建双sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体
2.6 构建双RGR元件的CRISPR/CAS9载体
2.7 将双RGR元件和普通sgRNA转录单元组合
2.8 构建PolⅡ型启动子驱动双RGR元件的载体
2.9 转基因阳性苗的检测
2.10 CRISPR/CAS9突变形式的检测与分析
3 结果与分析
3.1 水稻诱导型CRISPR/CAS9基因编辑效果检测
3.2 利用CRISPR/CAS9建立水稻中高效基因编辑系统
3.3 一种sgRNA靶向多个位点的基因编辑
3.4 使用多sgRNA转录盒进行多位点基因编辑
3.4.1 使用连续酶切的方法构建多sgRNA转录盒
3.4.2 使用一步酶切连接法构建多sgRNA转录盒
3.5 利用RGR技术进行多位点基因编辑
3.6 将已构建好的CRISPR载体与RGR元件组合应用于多基因编辑
3.7 水稻中使用PolⅡ类型的启动子启动sgRNA的效果
4 讨论
4.1 CRISPR/CAS9基因编辑材料的遗传稳定性
4.2 诱导型CRISPR/CAS9基因编辑的优点
4.3 快速获取可以稳定遗传的突变体
4.4 靶序列设计的注意事项
4.5 基因编辑材料的检测
4.6 多位点基因编辑的注意事项
4.7 RGR技术的应用范围
4.8 展望
4.8.1 利用CRISPR/CAS9构建水稻的突变体库
4.8.2 使用CRISPR/CAS9技术进行定点插入或替换
4.8.3 使用CRISPR/CAS9技术进行更加精确的点突变
4.8.4 利用CRISPR技术进行体外DNA编辑和克隆
4.8.5 CRISPR/CAS9技术对水稻育种的作用
第二章 花发育相关基因OsPIDa的功能研究
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 生长素相关基因的研究进展
1.2.1 生长素合成
1.2.2 生长素运输
1.2.3 生长素信号传导
1.3 生长素对水稻生长发育的影响
1.3.1 生长素调节水稻株型
1.3.2 生长素调控水稻花序发育
1.3.3 生长素影响水稻种子发育
1.3.4 生长素控制水稻根系的发育
1.3.5 生长素参与水稻胁迫反应
1.4 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 水稻材料及田间种植
2.2 菌株和载体
2.3 水稻T-DNA突变体的筛选
2.4 水稻TILLING突变体的筛选
2.5 水稻穗部性状的考察
2.6 水稻不同时期幼穗取样
2.7 水稻花粉粒育性的初步考察
2.8 各种载体的构建
2.8.1 过量表达载体与互补载体的构建
2.8.2 亚细胞定位载体的构建
2.8.3 CRISPR/CAS9载体的构建
2.9 水稻的基因型检测
2.9.1 T-DNA插入突变体的基因型检测
2.9.2 TILLING突变体的基因型检测
2.9.3 CRISPR/CAS9突变体的基因型检测
2.10 拟南芥原生质体的亚细胞定位
2.11 多序列比对与进化树分析
2.12 水稻表达谱数据分析
3 结果与分析
3.1 PID基因家族的同源比对与进化树分析
3.2 OsPID基因家族T-DNA插入突变体的筛选与鉴定
3.3 通过T-DNA插入突变体构建OsPID家族基因的双突变体
3.4 OsPID家族相关基因的TILLING突变体的筛选与鉴定
3.5 ospida-1,ospida-2突变体导致水稻结实率下降
3.6 ospida-1,ospida-2的遗传分析
3.6.1 ospida-1的基因型检测与遗传分析
3.6.2 ospida-2的基因型检测与遗传分析
3.7 ospida突变体对穗发育的影响
3.7.1 ospida突变体对穗部农艺性状的影响
3.7.2 ospida小花整体出现畸变
3.7.3 ospida-1的柱头严重退化
3.7.4 ospida-1雄蕊发生融合,花粉粒发育不良
3.7.5 ospida-1发生变异起始于枝梗原基发育之后
3.8 用OsPIDa的基因组序列互补ospida-1突变体
3.9 OsPIDa过量表达的效果
3.10 OsPIDa的表达谱分析
3.11 通过CRISPR/CAS9技术构建OsPIDa的突变体
3.12 OsPIDb的功能分析以及与OsPIDa的遗传关系
3.13 初步分析OsPIDa与几个花发育相关基因的关系
3.14 OsPIDa的亚细胞定位
4 讨论
4.1 水稻中生长素相关基因的鉴定
4.2 水稻生长素突变体的表型观察
4.3 OsPIDa对水稻花发育的影响和意义
4.4 OsPIDa在不同植物系统中的异同点
4.5 OsPID家族中其它基因的功能研究
4.6 展望
4.6.1 OsPIDa其他功能推测
4.6.2 OsPIDa在育种上的作用
参考文献
附录1
本研究所用引物信息
靶序列信息表
部分实验的详细操作程序
水稻的杂交
水稻总DNA的抽提
水稻总RNA的抽提
水稻的遗传转化
水稻RNA反转录
荧光实时定量PCR
扫描电镜制样与观察
石蜡组织切片
附录Ⅱ 在读期间研究成果
致谢
本文编号：4034756
【文章页数】：226 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 水稻CRISPR/CAS9技术构建
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 植物突变体构建方法的研究进展
1.2.1 随机诱变
1.2.1.1 物理诱变
1.2.1.2 化学诱变
1.2.1.3 DNA标签插入诱变
1.2.2 定点诱变
1.2.2.1 ZFN的原理及构建方法
1.2.2.2 TALEN原理及构建方法
1.2.2.3 CRISPR/CAS原理及构建方法
1.3 CRISPR/CAS9技术目前的研究进展
1.3.1 提高CRISPR/Cas9系统的生产力
1.3.1.1 针对CAS9进行密码子的优化
1.3.1.2 提高CRISPR/CAS9基因编辑特异性和效率
1.3.1.3 提高CRISPR/CAS9基因编辑后突变的遗传稳定性
1.3.1.4 使用CRISPR/CAS9进行多基因编辑
1.3.2 提高CRISPR/Cas9系统的质量控制
1.3.2.1 CRISPR/Cas9基因组编辑突变的检测
1.3.2.2 筛选稳定遗传株系
1.3.2.3 时空特异性基因编辑
1.3.2.4 提高CRISPR/CAS9基因编辑系统的精确性
1.3.2.5 获取不带有转基因片段的突变株系
1.4 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 水稻诱导型CRISPR/CAS9骨架载体的构建
2.2 水稻高效CRISPR/CAS9基因编辑骨架载体的构建
2.3 构建单sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体
2.4 通过两步酶切连接构建双sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体
2.5 通过一步酶切连接构建双sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体
2.6 构建双RGR元件的CRISPR/CAS9载体
2.7 将双RGR元件和普通sgRNA转录单元组合
2.8 构建PolⅡ型启动子驱动双RGR元件的载体
2.9 转基因阳性苗的检测
2.10 CRISPR/CAS9突变形式的检测与分析
3 结果与分析
3.1 水稻诱导型CRISPR/CAS9基因编辑效果检测
3.2 利用CRISPR/CAS9建立水稻中高效基因编辑系统
3.3 一种sgRNA靶向多个位点的基因编辑
3.4 使用多sgRNA转录盒进行多位点基因编辑
3.4.1 使用连续酶切的方法构建多sgRNA转录盒
3.4.2 使用一步酶切连接法构建多sgRNA转录盒
3.5 利用RGR技术进行多位点基因编辑
3.6 将已构建好的CRISPR载体与RGR元件组合应用于多基因编辑
3.7 水稻中使用PolⅡ类型的启动子启动sgRNA的效果
4 讨论
4.1 CRISPR/CAS9基因编辑材料的遗传稳定性
4.2 诱导型CRISPR/CAS9基因编辑的优点
4.3 快速获取可以稳定遗传的突变体
4.4 靶序列设计的注意事项
4.5 基因编辑材料的检测
4.6 多位点基因编辑的注意事项
4.7 RGR技术的应用范围
4.8 展望
4.8.1 利用CRISPR/CAS9构建水稻的突变体库
4.8.2 使用CRISPR/CAS9技术进行定点插入或替换
4.8.3 使用CRISPR/CAS9技术进行更加精确的点突变
4.8.4 利用CRISPR技术进行体外DNA编辑和克隆
4.8.5 CRISPR/CAS9技术对水稻育种的作用
第二章 花发育相关基因OsPIDa的功能研究
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 生长素相关基因的研究进展
1.2.1 生长素合成
1.2.2 生长素运输
1.2.3 生长素信号传导
1.3 生长素对水稻生长发育的影响
1.3.1 生长素调节水稻株型
1.3.2 生长素调控水稻花序发育
1.3.3 生长素影响水稻种子发育
1.3.4 生长素控制水稻根系的发育
1.3.5 生长素参与水稻胁迫反应
1.4 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 水稻材料及田间种植
2.2 菌株和载体
2.3 水稻T-DNA突变体的筛选
2.4 水稻TILLING突变体的筛选
2.5 水稻穗部性状的考察
2.6 水稻不同时期幼穗取样
2.7 水稻花粉粒育性的初步考察
2.8 各种载体的构建
2.8.1 过量表达载体与互补载体的构建
2.8.2 亚细胞定位载体的构建
2.8.3 CRISPR/CAS9载体的构建
2.9 水稻的基因型检测
2.9.1 T-DNA插入突变体的基因型检测
2.9.2 TILLING突变体的基因型检测
2.9.3 CRISPR/CAS9突变体的基因型检测
2.10 拟南芥原生质体的亚细胞定位
2.11 多序列比对与进化树分析
2.12 水稻表达谱数据分析
3 结果与分析
3.1 PID基因家族的同源比对与进化树分析
3.2 OsPID基因家族T-DNA插入突变体的筛选与鉴定
3.3 通过T-DNA插入突变体构建OsPID家族基因的双突变体
3.4 OsPID家族相关基因的TILLING突变体的筛选与鉴定
3.5 ospida-1,ospida-2突变体导致水稻结实率下降
3.6 ospida-1,ospida-2的遗传分析
3.6.1 ospida-1的基因型检测与遗传分析
3.6.2 ospida-2的基因型检测与遗传分析
3.7 ospida突变体对穗发育的影响
3.7.1 ospida突变体对穗部农艺性状的影响
3.7.2 ospida小花整体出现畸变
3.7.3 ospida-1的柱头严重退化
3.7.4 ospida-1雄蕊发生融合,花粉粒发育不良
3.7.5 ospida-1发生变异起始于枝梗原基发育之后
3.8 用OsPIDa的基因组序列互补ospida-1突变体
3.9 OsPIDa过量表达的效果
3.10 OsPIDa的表达谱分析
3.11 通过CRISPR/CAS9技术构建OsPIDa的突变体
3.12 OsPIDb的功能分析以及与OsPIDa的遗传关系
3.13 初步分析OsPIDa与几个花发育相关基因的关系
3.14 OsPIDa的亚细胞定位
4 讨论
4.1 水稻中生长素相关基因的鉴定
4.2 水稻生长素突变体的表型观察
4.3 OsPIDa对水稻花发育的影响和意义
4.4 OsPIDa在不同植物系统中的异同点
4.5 OsPID家族中其它基因的功能研究
4.6 展望
4.6.1 OsPIDa其他功能推测
4.6.2 OsPIDa在育种上的作用
参考文献
附录1
本研究所用引物信息
靶序列信息表
部分实验的详细操作程序
水稻的杂交
水稻总DNA的抽提
水稻总RNA的抽提
水稻的遗传转化
水稻RNA反转录
荧光实时定量PCR
扫描电镜制样与观察
石蜡组织切片
附录Ⅱ 在读期间研究成果
致谢
本文编号：4034756
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/4034756.html
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