罗非鱼红细胞免疫基因的筛选及干扰素调节因子1的表达研究

发布时间：2020-04-01 22:12

【摘要】：红细胞,特别是低等脊椎动物红细胞,除了能够完成气体运输外,可能在免疫、代谢中发挥重要功能。本文以尼罗罗非鱼为动物模型,观察尼罗罗非鱼红细胞和白细胞的形态及成熟红细胞胞质内细胞器的分布,检测罗非鱼红细胞中基因的表达情况。实验挑选平均体重在200±10g的尼罗罗非鱼,借助Ficoll离心法分离红细胞及白细胞,使用吉姆萨-瑞氏染色法及荧光染色法分别对罗非鱼红细胞和白细胞进行染色,并通过显微镜观察和计数。罗非鱼全血中红细胞占多数,红细胞形状为椭圆形,有一个近圆形的细胞核,位于细胞的中央。而白细胞数量较少,且形状不规则。纯化后的白细胞形态不一,由多种细胞构成。使用细胞分离液的分离效果较好,红细胞的比例高于99%,而白细胞的比例则大于95%。使用荧光染料处理罗非鱼红细胞以观察活体细胞器(溶酶体和线粒体),结果发现二者在细胞质中分布均匀。结果表明,罗非鱼成熟红细胞仍然具有细胞核和一些类型的细胞器,细胞结构相对完整。而这些完整的细胞结构,使得罗非鱼红细胞有可能具有转录和翻译蛋白质等细胞生物学功能。完成红白细胞分离后,借助高通量测序技术,对罗非鱼红细胞和白细胞的转录组进行测定及生物信息学分析。测序得到的原始数据通过筛选后分别得到4.24G和4.18G数据量。两端测序的总reads数均为14149487。样品的测序数据质量评估为:白细胞clean data的Q20达到96.04%,而Q30为88.54%;红细胞clean data的Q20达到97.72%,而Q30为90.63%。白细胞和红细胞转录组GO注释后,发现两种样本的注释结果相似程度较高。结果显示,注释到“molecular function”的次数最多(10,198,57.50%),其次是“bilogical process”和“cellular component”。将红细胞和白细胞转录组预测基因比对到KOG数据库进行分析。结果显示,共有14260个预测蛋白成功注释上KOG数据库。19,762个基因成功注释到COG数据库。聚类到“signal transduction mechanisms”中的基因数量与注释到其他条目的基因数量相比最多,共2427个;接着是“general function prediction only”和“transcription”,分别注释了1184和1036个基因;聚类到“defense mechanisms”的基因共有134个。将两种细胞的转录组进行差异分析后结果显示,共有20,876个基因检测到表达。其中,两种细胞中共同表达的基因有16,231个。在白细胞中特异表达的基因共有3,628个,而在红细胞中特异性表达的有1,017个基因。我们通过对两种细胞中共同表达的基因进行显著性差异分析,发现其中有3,251个基因存在显著差异。其中,707(21.75%)个基因在红细胞中的表达量显著高于在白细胞中的表达量,而2544(78.25%)个基因在红细胞中的表达量显著低于在白细胞中的表达量。对罗非鱼转录组的研究发现,罗非鱼红细胞转录组中含有大量免疫基因,包括模式识别受体、补体成分、炎症因子和受体、抗原提呈和处理分子、接头、效应因子和信号传导因子等几大类。同时,罗非鱼红细胞转录组的KEGG注释结果表明,罗非鱼红细胞包含了多种先天性免疫系统相关的信号通路,如Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、NOD样受体信号通路等。使用qPCR试验检测经poly(I:C)刺激24小时后的罗非鱼红细胞和白细胞。结果显示,白细胞免疫基因的扩增结果表明,7种免疫基因表达量均在poly(I:C)注射处理后出现上调。其中irf3和irf9为显著上调,而irf1、irf2、irf4、irf5和tlr3为极显著上调。对于罗非鱼红细胞,有5种免疫基因在处理后出现上调。其中,irf1和irf9为显著上调,而irf3、irf4和tlr3为极显著上调。而irf2未出现显著性变化。而irf5刺激后的表达量低于刺激前的表达量,但没有显著性。尼罗罗非鱼干扰素调节因子1(IRF1)的表达量在IRF家族中最高,实验克隆了尼罗罗非鱼IRF1基因cDNA全长,与其它脊椎动物IRF1基因进行比对,构建IRF家族系统进化树。然后使用polyI:C对尼罗罗非鱼进行体内注射诱导抗病毒免疫反应,利用荧光定量PCR技术检测处理组和对照组中尼罗罗非鱼各组织IRF1基因的表达差异。最后构建尼罗罗非鱼IRF1基因真核表达载体,对其进行细胞定位。结果发现,尼罗罗非鱼IRF1有888bp的开放读码框,能把编码295个氨基酸的蛋白序列。该蛋白N端高度保守,并含有6个保守的色氨酸,具有DNA结合结构域。对蛋白相似率的计算发现尼罗罗非鱼与斑马鱼IRF1相似度为52.1%。而与大鼠IRF1的相似率最低,为36.2%。IRF家族成员蛋白序列构建的系统进化树显示,IRF家族共分为四个亚群。将pCMV3-FLAG-IRF1真核表达载体转染到Hela细胞中后,对IRF1基因进行核定位发现,尼罗罗非鱼IRF1主要分布在细胞质中,细胞核中有少量分布。定量PCR检测到各个组织中IRF1在不同暴露时间下的表达水平有显著差异。
【图文】：

罗非鱼,红细胞

果罗非鱼血细胞形态学观察染色结束后，使用显微镜观察染色结果。如图 1-1 所示，通过对罗非鱼外周循统中全血及分离后的红、白细胞分别进行吉姆萨-瑞氏染色，观察到罗非鱼全视野下红细胞占多数，而白细胞数量较少，且形状不规则(1-1A)。罗非鱼红细数为椭圆形，胞质染色不明显，细胞核位于细胞中央，，呈圆形或椭圆形(1-1B)后的白细胞形态不一，由多种白细胞构成。其中，嗜中性粒细胞的细胞核成状，较小，位于细胞的一侧。淋巴细胞的细胞核较大，核质比较高(1-1C)。通算显微镜视野下各种细胞的数量以确定分离后红细胞和白细胞的纯度，我们使用细胞分离液的分离效果较好，红细胞的纯度高于 99%，而白细胞的纯度 90-95%。

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上海海洋大学硕士学位论文2.2 罗非鱼红细胞细胞器荧光染色结果观察荧光染色结束后罗非鱼红细胞细胞器的染色情况见图 1-2。如图 1-2 所示，利用纯化后的罗非鱼红细胞结合细胞器荧光染色试剂对红细胞中的细胞器进行染色，结果显示，染色后的红细胞在荧光显微镜的观察下显示有绿色荧光及红色荧光。荧光染色结果表明，在罗非鱼红细胞细中，不仅存在细胞核，在细胞质中还存在一定的细胞器，如溶酶体和线粒体等 (图 1-2)。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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