【摘要】：刺激隐核虫是一种海洋寄生性纤毛虫,其生活史具有多态性,必须经历寄生于海水硬骨鱼体表的滋养体阶段,是引起"海水白点病"的病原生物。近年来随着养殖密度的增大,对海水养殖业造成的影响日益严重,引起了巨大的经济损失。目前的物理、化学防治方法均无法起到有效作用,因而亟待研究出可行的防治方法。本实验从Cryptocaryon irritans滋养体cDNA文库中筛选出一个类木瓜蛋白酶(papain-like protease,CiPCP)的 cDNA,通过 5'RACE(Rapid Amplification of 5'-end of cDNA)方法获得完整开放阅读框,对其进行分子特征分析,并初步评价了该蛋白对大黄鱼的免疫预防作用。CiPCP开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)由984 bp碱基组成,编码327个氨基酸,分子量理论值为37.6 kDa。实验中以人工合成的方式完成其中14个非通用密码子的修改,获得适合在原核系统表达的CiPCP ORF序列,并亚克隆出5'端下游301 bp之后编码成熟酶结构域的684 bp碱基序列(CiPCt),重组于pET 28a载体后转化到E.coli BL-21(DE3)菌株,通过自诱导方式获得融合蛋白rCiPCPt。以rCiPCPt免疫小鼠获得抗血清,用于Western Blotting分析,结果表明该蛋白具有良好的免疫原性,可特异性识别C.irritans各时期的天然蛋白。同时,该结果也说明C.irritan 天然CiPCP经水解去除前肽,形成26 kDa左右的成熟酶。利用间接免疫荧光抗体试验对C.irritans幼虫时期的CiPCP进行定位,结果显示该蛋白酶主要分布于胞口,属于分泌型蛋白酶,与生物信息学预测结果相符。大黄鱼经抗原rCiPCPt免疫后,获得了对C.irritans致死剂量(45,000 theront/fish)的感染性幼虫攻击54%的免疫保护率,实时定量PCR显示大黄鱼脾脏中的interleukin-1β的表达上调。综合分析,初步证明该蛋白对大黄鱼的C.irritans感染具有一定的免疫保护作用,为"海水白点病"的防治研究提供了线索。
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941.5
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