半滑舌鳎抗病相关SNP标记的筛选及两种免疫相关基因的克隆与初步分析

发布时间：2020-06-02 07:42

【摘要】：半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国特有的名贵海水养殖鱼类,其味道鲜美、口感爽滑、营养丰富,深受广大消费者喜爱,极具市场经济价值和养殖开发潜力。然而,高密度、集约化的养殖模式以及环境污染等原因,致使半滑舌鳎腹水、烂鳍、烂尾等细菌性疾病日益突出,严重制约了半滑舌鳎工厂化养殖产业的发展。将传统选择育种模式与分子标记辅助选择育种技术相结合,有利于半滑舌鳎抗性品系的培育,单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)被认为是一种极具应用前景的分子标记技术。本文以半滑舌鳎为研究材料,克隆了半滑舌鳎两种免疫相关基因Nramp和IL-10,并进行了初步分析研究;利用直接测序法筛选了Nramp基因抗病相关的SNP分子标记,以期为半滑舌鳎抗性品系培育提供技术支持。主要研究结果如下:1.半滑舌鳎免疫相关基因的克隆与初步分析研究利用c DNA末端快速扩增技术,对半滑舌鳎天然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural resistance associated macrophage protein,Nramp)和白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10)基因分别进行了克隆,并对其序列结构进行了分析研究。随后,对半滑舌鳎Nramp和IL-10基因感染哈维氏弧菌前后转录组水平的表达分析进行研究;并对半滑舌鳎IL-10基因原核表达进行了初步探索。1)半滑舌鳎Nramp基因克隆与表达分析Nramp属于膜整合转运蛋白,具有抑制胞内寄生菌侵染、调节巨噬细胞抗菌活性等作用。本研究克隆了半滑舌鳎Nramp基因的c DNA序列,该基因全长3717bp,具有16个外显子,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为1677 bp,所编码蛋白含有558个氨基酸,该蛋白具有Nramp家族的典型特征:包括10个跨膜区(transmembrane,TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运蛋白特征结构域(consensus transport motif,CTM)。半滑舌鳎Nramp基因其ORF末端有1个类似于脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(iron-responsive regulatory-protein-binding sites,IRE)。半滑舌鳎Nramp与其他14个物种的Nramp氨基酸序列同源性在63~91%之间,系统进化分析表明,半滑舌鳎Nramp和所有鱼类Nramp聚集为一簇,与其他物种Nramp2的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,Nramp基因在半滑舌鳎脾脏和肾脏中的表达量最高,而在肌肉和性腺中的表达量最低;在哈维氏弧菌感染后的半滑舌鳎肾脏、脾脏和肝脏中表达量呈升高趋势,而在鳃中则表现为下调趋势。2)半滑舌鳎IL-10基因克隆与原核表达IL-10是一种具有广泛作用的细胞因子,其主要功能是抑制和终止炎症反应。本研究克隆了半滑舌鳎IL-10基因的c DNA序列,该基因全长935 bp,具有5个外显子,其ORF为561 bp,所编码蛋白含有186个氨基酸,包含4个保守的半胱氨酸残基构成2对二硫键,该蛋白具有IL-10家族的特征序列:G-X2-KA-X2-[D,E]-X-D-[ILV]-[FLV]-[FILMV]-X2-[ILMV][EKQR]。半滑舌鳎IL-10与其他15个物种的IL-10氨基酸序列同源性在27~62%之间,系统进化分析表明,半滑舌鳎IL-10与红鳍东方渶、大西洋鳕、欧洲鲈鱼和青斑河豚的亲缘关系最近,聚集为一支;而在高等动物中与原鸡的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,半滑舌鳎IL-10 m RNA主要在肝脏、心脏、皮肤和肠中表达;在哈维氏弧菌感染后的肝脏和鳃中表达量呈下调趋势,而脾脏则表现为升高趋势。根据半滑舌鳎IL-10的c DNA序列设计表达引物,利用p EASY原核表达载体试剂盒(p EASY-E1 Expression Kit)构建重组表达质粒,经测序正确后,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组质粒蛋白表达;聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测显示重组融合蛋白在分子量约21 k D处有明显目的表达条带,与预测分子量大小一致,且主要以不可溶的包涵体形式存在;Western Blot检测发现多克隆抗体可与半滑舌鳎IL-10重组融合蛋白有效结合。2.半滑舌鳎免疫相关基因抗病分子标记筛选为筛选半滑舌鳎候选基因Nramp和TLR-9抗病相关的SNP标记,利用直接测序法对233个半滑舌鳎个体(死亡个体68个,存活个体165个)进行了抗病相关SNP标记筛选。首先构建了死亡和存活个体基因池(死亡个体和存活个体各20个),并利用引物对其进行初步扫描;对在死亡和存活个体基因池中初步筛选到的SNP位点,用构成死亡和存活个体基因池的40个个体进行第一次单个体验证;对于在第一次个体验证中差异显著的SNP位点在剩余193个个体中进行第二次单个体验证。结果显示,在TLR-9中初步筛选到3个SNP位点,而在Nramp中筛选到15个SNP位点;经第一次单个体验证发现,TLR-9基因的3个SNP位点在死亡和存活个体中无显著性差异,而Nramp基因中有1个SNP-g.3125位点在存活和死亡个体中呈显著性差异;对Nramp基因SNP位点进行第二次单个体验证发现,半滑舌鳎Nramp基因中的SNP-g.3125等位基因(G)和基因型(GG)与半滑舌鳎抗鳗弧菌疾病呈极显著相关性(P㩳0.01)。因此,Nramp基因该SNP位点可作为半滑舌鳎抗病育种的一个潜在的遗传标记位点,为半滑舌鳎抗性品系培育的遗传分子标记提供基础研究资料。
【图文】：

DNA琼脂糖凝胶电泳,全基因组,图片,基因组

提取的半滑舌鳎基因组 DNA 经 1%琼脂糖凝胶电泳检测（见图 2-1），所提取的基因组 DNA 条带清晰，无明显拖尾现象，，完整性较好。利用 DNA/ RNA 定量仪检测基因组 DNA，其中 OD260/OD280比值在 1.8~2.0 之间，表明提取的基因组 DNA 质量较高；浓度在之间，用 ddH2O 稀释至 100 ng/μl，-20℃保存备用。

PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图片
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【参考文献】