虾肝肠胞虫Taqman荧光定量PCR检测技术的建立及其与对虾生长相关性的研究

发布时间：2020-06-10 03:50

【摘要】：近年来,东南亚对虾养殖场已报道了越来越多的对虾生长缓慢的现象,这些养殖场的对虾严重地感染了一种微孢子虫,即虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP),该寄生虫是2009年Tourtip等在泰国养殖的生长缓慢的班节对虾(Penaeus monodon)中最早发现。EHP为胞内寄生虫,属于微孢子虫科、肠胞虫属,繁殖方式是在宿主肝胰腺小管上皮细胞的细胞质内进行复制。EHP感染并没有明显的临床症状,对于该现象的诊断主要通过组织学观察、PCR法、地高辛标记核酸探针原位杂交法以及LAMP检测方法。为了不仅能够定性检测,也能够定量检测,因此本实验室建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR用于检测EHP。经实验证明建立的此方法具备了检测方法的标准,可以用来定量的检测实际样品,为EHP的检测和防控提供了又一技术手段。然而在定量检测的方法中,Taqman探针法更能够被广泛的接受,其技术原理决定了该方法的高特异性,能够有效的避免反应过程中的非特异性扩增,其准确度也大大的提高了,无论在水生生物还是其他生物的病原检测中均得到了广泛的认可。并且在虾类病原的监测防控方法的收录中,OIE检测标准更倾向于将Taqman探针作为标准方法。因此,为了更加精确地定量检测EHP,本文建立了Taqman探针荧光定量PCR检测技术,并用该技术检测了从各地区采集的对虾样品。本文建立的虾肝肠胞虫Taqman探针荧光定量PCR检测方法,是针对6.1×101—6.1×108 copies/μL的EHP SSU rDNA标准品,从检测结果表明该方法的线性关系较好,并且具有较好的组间和组内重复性。通过对实际样品检测来比较本研究建立的方法、套式PCR和SYBR Green I qPCR-EHP这三种方法。由实验结果可以看出,Taqman qPCR-EHP比套式PCR灵敏度高7.6±4.2倍,比SYBR Green I qPCR-EHP高1.3±0.2倍。Taqman qPCR-EHP阳性检出率(93.5%)明显高于套式PCR阳性检出率(77.4%),也略高于SYBR Green I qPCR-EHP阳性检出率(88.7%);与Taqman qPCR-EHP相比,套式PCR和SYBR Green I q PCR-EHP的诊断特异性为100%,诊断敏感性分别为82.8%和96.6%,这表明Taqman qPCR-EHP有更高的诊断敏感性。Taqman qPCR-EHP和SYBR Green I qPCR-EHP定量结果的相关性较高,数值可比性好。本论文还对采集自天津、浙江的四批对虾样品进行逐尾体长,体重测量,计算出体质指数(BMI),抽提各尾对虾肝胰腺的总DNA样品,利用Taqman qPCR-EHP检测肝胰腺DNA样品中的EHP载量,结果表明,在来自天津的样品中,EHP载量与BMI存在负相关性,即EHP影响对虾的生长状态,这与我们采用SYBR Green I荧光定量PCR方法所得出的结论类似,而且Taqman qPCR-EHP方法还直接证明了对EHP采取某种治疗手段的前后两次采集的样品中的EHP载量出现明显的下降,治疗后的EHP载量的对数平均值下降到治疗前的(48.4±39.4)%,说明建立的qPCR方法能用于EHP治疗效果的评价。对采集自天津、浙江和山东等养殖场的5个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体的442尾个体进行虾肝肠孢虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的Taqman探针荧光定量PCR检测,并测量各群体每尾对虾的生物学体长和体重。引入医学上的劳累尔(Rohrer)体重指数(Ponderal index,Pi,W/L3)关系建立对虾体重(W)和体长(L)关系函数。结果表明,4个凡纳滨对虾的EHP阳性群体(平均体长5.37±1.19 cm)的体重指数Pi均值为(5.19±0.26)×10-3 g/cm3,EHP阴性群体的凡纳滨对虾群体(平均体长2.49±0.21)为(7.96±0.51)×10-3 g/cm3,根据Pi=a L(b-3)的函数矫正EHP阴性和阳性群体的体长差异引起的Pi差值后,同等体长下EHP阳性群体的Pi值为阴性群体的(70.5±8.7)%,表明同样大小的个体,EHP阳性群体的平均体重比阴性群体低三成;EHP阳性群体中凡纳滨对虾体长和体重的变异系数是EHP阴性群体的2.39±0.93和2.05±0.86倍,表现为EHP阳性的对虾群体个体大小不均匀;EHP阳性群体体重偏差率是EHP阴性群体的2.34—3.45倍,体长相同时,EHP阳性的体重波动变大。
【图文】：

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上海海洋大学硕士学位论文17图2-2 虾肝肠胞虫SSU rDNATaqman qPCR特异性分析的扩增曲线Fig. 2-2 Amplification curve of specificity analysis of the Taqman qPCR for the SSU rDNA ofmicrosporidian E. hepatopenaei图3 虾肝肠胞虫SSU rDNATaqman qPCR扩增产物的电泳M：DL2000；1：EHP的PCR检测为阳性的凡纳滨对虾样品总DNA，N：阴性对照Fig. 3 Gel electrophoresis of Taqman qPCR products of Microsporidian E. hepatopenaeiM: DL2000; 1: Total DNA of L. vannamei infected with EHP; N: Negative control

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Fig. 2-2 Amplification curve of specificity analysis of the Taqman qPCR for the SSU rDNA ofmicrosporidian E. hepatopenaei图3 虾肝肠胞虫SSU rDNATaqman qPCR扩增产物的电泳M：DL2000；1：EHP的PCR检测为阳性的凡纳滨对虾样品总DNA，N：阴性对照Fig. 3 Gel electrophoresis of Taqman qPCR products of Microsporidian E. hepatopenaeiM: DL2000; 1: Total DNA of L. vannamei infected with EHP; N: Negative control
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.4

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