魁蚶MyD88、CAT和GST的克隆及功能分析

发布时间：2020-06-10 18:05

【摘要】：魁蚶是一种高蛋白、低脂肪的水产品,具有良好的市场前景和经济价值。与其他软体动物一样,魁蚶也主要依靠非特异性免疫因子进行免疫防御活动,同时魁蚶又具有其特殊性,即其血淋巴中含有红细胞,而且红细胞已被证明不仅具有运输氧气的功能而且还能够发挥免疫作用。目前,魁蚶免疫相关基因的报道不多,只有锰超氧化物歧化酶、铁蛋白、半乳糖凝集素、大防御素等少数几个基因。因此深入开展魁蚶免疫因子的相关研究,对于丰富魁蚶免疫学资料具有重要意义。本文采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(SbCAT)、魁蚶髓样分化因子88(SbMyD88)和魁蚶谷胱甘肽硫转移酶(SbGSTμ)基因的cDNA全长序列,并对它们进行了一定的功能初步分析。SbMyD88基因全长为1564 bp,包括1326 bp的ORF(open reading frame),编码442个氨基酸,预测分子量为50.2 kDa,理论等电点为5.32。SbMyD88氨基酸序列具有MyD88家族典型的死亡结构域和TIR结构域,在TIR结构域中含有3个高度保守区,即box1、box2和box3。同源性分析显示,SbMyD88氨基酸与其它所选软体动物的氨基酸具有较高的相似性,其相似度为47%-61%。SbMyD88在系统进化树中,先和贝类的MyD88聚为一支,后和脊椎动物聚在一起。qRT-PCR(quantitative real-time PCR)检测发现,SbMyD88基因在魁蚶各组织器官中均有表达,其中在肝胰腺中表达量最低,在鳃中的表达量最高,为肝胰腺的348.72倍。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,SbMyD88在各个组织均表现出先上升再下降的趋势。SbCAT基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5’端非翻译区(UTR)和654 bp的3’-UTR。ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 kDa,理论等电点为8.03。SbCAT氨基酸与其它所选动物的氨基酸具有较高的相似性,其相似度为68%-96%,SbCAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点(61FNRERIPE RVVHAKGAG77),1个亚铁血红素结合位点(351RLFSYPDTH359)及3个催化位点残基His-72,Asn-145和Tyr-355。此外,SbCAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了SbCAT的组织表达特征。结果显示,SbCAT mRNA在所检测的6种组织中均有表达,其中在外套膜中表达水平量较高,在肝胰腺和血淋巴中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,除鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。SbGSTμ基因全长1040 bp,包括648 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),144 bp的5’端非翻译区(UTR)和248 bp的3’-UTR。ORF编码216个氨基酸,预测分子量为24.9 kDa,理论等电点为8.11。SbGSTμ氨基酸与其它所选动物的氨基酸具有较高的相似性,其相似度为49%-70%。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了SbGSTμ的组织表达特征。结果显示,SbGSTμmRNA在所检测的6种组织中均有表达,经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌和CuSO4刺激后,各个组织均表现出先上升再下降的趋势。将该基因的编码区重组到p ET-28(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达。重组蛋白SbGSTμ浓度为0.487 mg/ml,蛋白活性的最适pH和温度分别为7.4和40℃。经体外攻毒试验,重组蛋白SbGSTμ能够减少BaP对DNA碱基的损伤。
【图文】：

氨基酸序列,氨基酸序列,编码基因,魁蚶

用 Clustalx 对 SbGSTμ氨基酸序列与其他 10 种动物的氨基酸序列进行了多序比对（图 2-2）。SbGSTμ 氨基酸序列与九孔螺的相似性最高，为 70%，与图-2 的其他动物的相似性也超过了 49%。，用 Mega 5.0 软件以邻位相接法（NJ 法）建了 GSTμ 氨基酸的进化树（图 2-3），，结构显示，魁蚶先与 μ 家族的软体动物为一支，再和 μ 家族其他动物聚为一支，最后和其他 GST 家族的聚为一支。

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上海海洋大学硕士学位论文l-length of cDNAand deduced amino acid sequencATG) and stop codon (TAA) are highlighted. P lines. Predicted C-terminal is shaded. μ nd ploy(A) are underlined with continuous and bro
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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