日本沼虾蜕皮启动激素受体基因（ETHR）和生殖母细胞特有因子1（Gtsf1）基因的克隆及功能研究

发布时间：2020-06-16 07:16

【摘要】：青虾,学名日本沼虾(Macmbrachium nipponense),隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda),长臂虾科(Palaemonidae),沼虾属(Macrobrachium),主要分布在中国、日本、朝鲜半岛和越南北部等国家的淡水水域。青虾具有生长快、繁殖力强、适应性广、经济价值高等特点,是我国淡水养殖的主要品种之一。近年来青虾相关重要功能基因被广泛研究,同时也是本实验室的科研重点。目前本实验室已对与生殖、生长和性别相关的GIH、Vg、VgR、IAG等近20个功能基因进行了系统的科学研究。已报道,蜕皮启动激素受体(Ecdysistriggering hormone receptor,ETHR)在昆虫蜕皮过程中发挥重要作用,生殖母细胞特有因子1(Gametocyte-specific factor 1,Gtsfl)在调控昆虫和哺乳动物生殖细胞发育中具有重要功能,但在青虾中未见上述2个基因相关研究的报道。本文从本实验室构建的青虾精卵巢表达谱中筛选得到ETHR和Gtsf1的同源EST序列,在此基础上进行cDNA克隆、成体组织和发育过程表达模式分析以及RNA干扰研究,以阐明ETHR和Gtsf1在青虾中承担的功能,藉此推动青虾蜕皮和生殖细胞发育机制的研究。ETHR是一种G蛋白偶联受体,它在昆虫蜕皮过程中发挥着重要的生理作用,但在甲壳动物中未见相关研究报道。采用RACE技术克隆获得青虾ETHR基因cDNA序列长 1349 bp(Gen Bank 登录号:KU532132),开放阅读框(Open reading frame,ORF)为1173 bp,编码390个氨基酸。生物信息学分析预测青虾ETHR蛋白包含七个跨膜结构域和在节肢动物中高度保守的特定功能位点,并发现该蛋白无信号肽,属于非分泌蛋白。系统进化树分析表明青虾ETHR蛋白与甲壳纲的大型水蚤(Daphnia magna)亲缘关系最近。十个不同组织中的表达分析结果显示,在脑组织中表达最高,表明大脑是ETHR活动的重要功能场所。胚胎不同发育时期表达结果显示,ETHR基因在胚胎发育早期表达水平较低(卵裂、囊胚、原肠胚期),在无节幼体期逐渐增加,到蚤状幼体阶段ETHR基因的表达量显著增加(P0.05),出膜后表达量急剧升高(P0.05)。蜕皮周期表达结果发现,在脑组织和表皮中均发现ETHR在蜕皮前期迅速上升(P0.05),蜕皮后ETHR又恢复到较低水平,说明ETHR与青虾蜕皮密切相关。RNA干扰降低了 ETHR的表达量,并使实验组青虾蜕皮频率降低,约为对照组的一半,表明ETHR具有促进青虾蜕皮的作用。眼柄摘除能显著提升ETHRmRNA的表达,同时蜕皮频率在眼柄摘除后升高了 30%,表明眼柄对ETHR基因表达和蜕皮具有抑制作用。Gtsf1基因参与果蝇和小鼠的性腺发育调控,在维持生殖细胞正常生成中发挥着重要作用,但在甲壳动物中未见研究报道。为了研究青虾性早熟现象,本文采用RACE技术克隆获得青虾Gtsf1基因cDNA序列长349 bp((GenBank登录号:KR349325),开放阅读框(Open reading frame,ORF)为240 bp,编码79个氦基酸。生物信息学分析预测青虾Gtsf1蛋白包含1个zf-U11-48K结构域,并发现该蛋白无信号肽,属于非分泌蛋白。系统进化树分析表明Gtsf1基因青虾Gtsf1蛋白与昆虫纲的蝽类(Lygus hesperus)亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,Gtsf1基因在性腺中表达很高,特别是在卵巢中表达最高(为精巢的6倍),其他组织中表达极低。卵巢不同发育时期表达结果发现,发育初期Gtsf1基因表达水平较低,随着卵巢的发育,该基因的表达水平呈现显著上升趋势(P0.05),在成熟期达到最高峰,在消退期显著下降并恢复到较低水平(P0.05)。胚胎和胚后不同发育时期结果显示,Gtsf1基因在胚胎发育早期表达水平较高,囊胚期时显著升高并达到峰值(P0.05),从原肠期显著下降直至变态后第10天该基因表达水平维持较低水平(P0.05)。以上研究结果表明Gtsf1基因与生殖密切相关,特别是在卵巢发育过程中有关,且呈正相关趋势。同时,Gtsf1基因可能主要参与青虾胚胎早期发育的调控。研究首次在甲壳动物中克隆获得Gtsf1基因,并分析Gtsf1基因在青虾中的时空表达模式,研究结果为进一步研究Gtsf1基因在青虾的功能奠定了基础。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【图文】：

明喻,生殖细胞

化生物学等学科在内的诸多领域显示出其强大的生命力。一般认为生殖细胞的发生分逡逑为原始生殖细胞（Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ邋Ｇｅｒｍ邋Ｃｅｌｌｓ，ＰＧ．Ｃｓ）的形成、迁移、胚胎性腺的发生以及配逡逑子发生等几个主要的发育阶段，如图１－１邋（邵明喻，２００７）。生殖细胞是由存在卵子中逡逑—类特殊的细胞逦生殖质（ｎｕａｇｅ或ｇｅｒｍ邋ｇｒａｎｕｌｅｓ）发育而来；生殖质被认为是生逡逑殖细胞的发源地，同时也被叫做维持种系延续的基地（桂建芳，２００４；吴萍，２００９）。逡逑目前己经可以通过Ｖａｓａ、ｎａｎｏｓ等生殖细胞标记基因来追踪ＰＧＣｓ的发育和迁移逡逑（Ｙｏｏｎ邋ｅｔａｌ．，１９９７；邋Ｗｙｌｉｅ邋ｅｔａｌ．，２０００；邋Ｅｘｔａｖｏｕｒ邋ａｎｄ邋ＡｋａｍＭ，２００３）。逡逑逦胚胎发育逦逦配于发生逦逡逑ＰＧＣｓ形成｜邋ＰＧＣｓ迁移Ｉ胚胎性腺发生逦Ｉ分裂增殖｜减数分裂Ｉ逦精子形成逡逑２—邋一邋＂逦—衰逡逑Ｕ逡逑图１－１生殖细胞的发生（引自邵明喻，２００７）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ｏｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｇｅｎｉｉ邋ｃｅｌｌ逡逑根据生殖细胞的发育程度可分为：原原始生殖细胞、原始生殖细胞、性原细胞、逡逑性母细胞和配子。原原始生殖细胞（ｐＰＧＣ）是生殖细胞的始祖细胞，进行不对称细逡逑胞分裂，产生两个子细胞，其中一个子细胞维持生殖干细胞的特性，而另一个子细胞逡逑发育分化为体细胞；原始生殖细胞（ＰＧＣ）是性原细胞的祖细胞，其在迁移到达性腺逡逑原基过程中，发生分裂产生的子细胞，并在细胞周围的环境影响下，发育成为性原细逡逑胞

成虾,日本沼虾,基因

ＥＴＨＲ主要位于中枢神经系统中，在脑中的表达量最高，其次是眼柄，鳃、肝逡逑脏、肌肉、腹腔神经节和表皮。在卵巢、精巢和心脏中的表达显著降低。在胚胎发育逡逑过程中ＥＴＨＲ的ｍＲＮＡ表达呈现一个上升趋势（图２－５），ＥＴＨＲ在早期胚胎发育过逡逑程中的表达较低，而在虽状幼体期的表达水平显著增加，出膜后ＥＴＨＲ表达量急剧升逡逑尚。逡逑６００邋－Ｉ邋３逡逑Ｓ逦５００逦－邋Ｉ逡逑？§逦４００逦－逦■逡逑Ｉ逦３００逦－逦Ｉ逦＂逦Ｔ逦＂逦＂逦ｂ逦ｂ逡逑Ｂｒ逦Ｅｙ逦Ｇｉ逦Ｈｅｐ逦Ｍｕ逦Ａｇ逦Ｅｐ邋0ｖ邋Ｔｅ邋Ｈｅａ逡逑Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑图２－４：日本沼虾ＥＴＨＲ基因在成虾不同组的表达逡逑Ｆｉｇ．２－４：邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐｒｏｆｉｌｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＥＴＨＲ邋ｇｅｎｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｒｅｖｅａｌｅｄ邋ｂｙ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ逡逑ＰＣＲ逡逑注：组织包括脑、眼柄、鳃、肝脏、肌肉、腹神经节、卵巢、精巢和心脏。数据显示为平均值士逡逑标准差。不同组织间的统计学差异用大写字母表示，不同的字母表示差异显著（Ｐ＜邋０．０５）。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｉｎｃｌｕｄｅｄ：邋Ｂｒ，ｂｒａｉｎ；邋Ｅｙ，邋ｅｙｅｓｔａｌｋ；邋Ｇｉ，ｇｉｌｌ；邋Ｈｅｐ，ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ．邋Ｍｕ，逡逑ｍｕｓｃｌｅ；邋Ａｇ

【参考文献】