IHHNV衣壳蛋白—凡纳滨对虾鳃细胞膜受体的初步研究

发布时间：2020-06-17 18:53

【摘要】：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒病(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis,IHHN)为对虾主要病毒病之一,近些年,IHHNV流行范围遍布全球各地,造成严重的经济损失。IHHHV敏感宿主是细角滨对虾和凡纳滨对虾,对细角滨对虾引起急性感染和高死亡率,对凡纳滨对虾可导致慢性矮小残缺综合症(RDS),对养殖业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将IHHNV列为须向其申报的甲壳类重要疾病之一。目前,IHHNV在流行病学和诊断方面受到重视,但其致病机理鲜有报道。本文重点着力于IHHNV衣壳蛋白鳃细胞膜受体的研究,通过VOPBA、Pull Down、噬菌体随机十二肽库,筛选IHHNV CP受体蛋白,为IHHNV进一步研究提供依据。本文首先提取IHHNV射阳株发病凡纳滨对虾鳃组织的DNA,根据GenBank公布的射阳株序列(Accession KF214742)设计引物构建了 IHHNV CP原核表达载体。进行蛋白原核表达,目的蛋白主要以包涵体形式表达,用HisTrapTM HP柱纯化目的蛋白后,进行尿素透析,将透析后的蛋白免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,三免后抗体效价达到1:102400。利用匀浆、超速离心分离未感染IHHNV凡纳滨对虾的鳃细胞膜蛋白,获得均匀分布的凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白条带。利用VOPBA结合Pull Down实验筛选IHHNV CP凡纳滨对虾鳃细胞膜受体,得到 Signal transducer and activator of transcription(STAT 信号转导与转录激活因子)、Heat shock protein 90(热休克蛋白 90)、Prophenoloxidase-2(酚氧化酶原 2 型)、Na+/K+-ATPase alpha subunit(Na+/K+-ATP 酶 a 亚基)、NM23 protein 五种蛋白。将 NM23 基因构建到pGEX-4t-1原核表达载体上,进行原核表达,用GST磁珠进行纯化,进行NM23与CP的VOPBA和NM23与CP的GSTPullDown验证实验,结果表明,NM23能与IHHNV CP相互作用。利用噬菌体随机十二肽库淘选IHHNV CP结合肽,经过三次亲和→洗脱→扩增→亲和的循环淘洗过程,得到6种十二肽可以与IHHNV CP结合,A(SWSSWVYRDPQT)、B(HSFKWLDSPRLR)、C(SSFKWLDSPRLR)、D(HRSKWVYSDPQR)、E(YWSKWVDWHPQR)、F(SSCKWVDWD*AE),其中 B与C只相差第一个氨基酸,B是H,C是S。D与E均含有SKWV和PQR,可能是IHHNVCP的特征结合肽。序列A(SWSSWVYRDPQT)与NM23蛋白比对后发现,SW*Y(*为ⅤV或Ⅰ)也可能是IHHNV CP的特征结合肽.通过之前VOPBA和GST Pull Down验证实验,进一步证明IHHNV CP能与NM23 protein相互作用。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945.4
【图文】：

条带,蛋白,切胶,银染

Ｌａｎｅ邋１邋ＢＬ２１－邋ｐＧＥＸ－４＾１－ＮＭ２３邋十邋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；Ｍ．Ｐｒｏ化化邋Ｍａｒｋｅｒ．逡逑２．２．３邋ＮＭ２３邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ邋Ｄｏｗｎ逡逑洗脱液取等量，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，银染结果如图５－９。Ｌａｎｅ邋１中在３５－４０逡逑ｋＤａ，相比Ｌａｎｅ邋２有一条带，与出ＨＮＶ邋ＣＰ位置相符；Ｌａｎｅ邋３和Ｌａｎｅ邋４在相应逡逑位置没有条带，排除ＧＳＴ于ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ作用的可能；Ｌａｎｅ邋３在相应位置没有条带，逡逑说明洗涂杂蛋白充分。将Ｌａｎｅ邋１邋３５－４０邋ｋＤａ之间的条带切胶做ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，逡逑ＩＨＨＮＶＣＰ随ＧＳＴ－ＮＭ２３蛋白一同洗脱下来，证明二者存在相互作用，结果如表逡逑５－４。逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋１逦２逦３逦４逡逑７０－逦＾逡逑－＇ＷＷｉ逡逑５５－逦＿＾４邋…ａ邋灥。逡逑４０－邋ｇｐ＾ＨＵＰ邋ＷＨＰ逡逑。姦邋ａ－逦ｉｐｉ逡逑３５．邋ａｆｅ邋－邋ｍ邋Ｊ0邋—逡逑图邋５－９邋ＧＳＴ邋Ｐ山邋１邋Ｄｏｗｎ邋的邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋分析逡逑Ｆｉｇ邋５－９邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＧＳＴ邋Ｐ山１邋Ｄｏｗｎ逡逑Ｌａｎｅ邋ＬＯＳＴ邋－ＮＭ２３＋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；Ｌａｎｅ邋２．邋ＧＳＴ邋－ＮＭ２３；Ｌａｎｅ邋３．邋ＧＳＴ邋＋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；逡逑Ｌａｎｅ邋４．邋ＧＳＴ；Ｍ．蛋白邋Ｍａｒｋｅｒ．逡逑Ｌａｎｅ邋ｌ．ＧＳＴ邋－ＮＭ２３＋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；Ｌａｎｅ邋２．邋ＧＳＴ邋－ＮＭＵ；Ｌ抑ｅ邋３．邋ＧＳＴ邋＋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ

蛋白,切胶,条带,银染

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【参考文献】