三角帆蚌贝壳基质蛋白基因hic24和Hc-temptin鉴定及功能初步研究

发布时间：2020-06-29 18:33

【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)属于我国特有淡水珍珠蚌,所产珍珠产量已达到世界珍珠总产量的80%以上。研究表明,基质蛋白作为贝壳和珍珠有机成分中的重要组成,对贝壳和珍珠形成发挥着重要作用。对基质蛋白的研究、鉴定和分析对我国珍珠产业的高质量发展有着重要意义。本实验从三角帆蚌中分离鉴定出2个贝壳基质蛋白基因,并对其结构和功能进行初步的探究。从三角帆蚌外套膜中克隆得到2个基质蛋白基因hic24和Hc-temptin。其中hic24基因cDNA序列全长为756bp,拥有一个654bp的开放阅读框,理论分子量为23.5 kDa,等电点为6.36,为一个酸性基质蛋白。hic24基因编码217个氨基酸,包括一个18个氨基酸的信号肽。二级结构预测显示其主要为β折叠结构,同时该序列富含Gly残基,占氨基酸含量的11.5%。Hc-temptin基因cDNA序列全长为884bp,含有一个411bp的开放阅读框(ORF),编码136个氨基酸。理论分子量为14.7 kDa,等电点为7.60。预测前21个氨基酸为信号肽,氨基酸组成中富含Ser、Asn以及Gly残基,分别占氨基酸含量的10.3%、10.3%、9.6%。通过组织荧光定量显示,两个基质蛋白基因均在外套膜组织中特异性表达较高。在原位杂交实验中,hic24基因在外套膜中央膜背上皮细胞中特异性表达,Hc-temptin基因在外套膜边缘膜背上皮细胞中特异性表达,因此推测hic24基质蛋白基因参与了贝壳珍珠层的形成,Hc-temptin基因可能在贝壳棱柱层形成时起重要作用。在RNA干扰实验中,注射20μg/100μL以及40μg/100μL的dsRNA后,通过荧光定量实验,检测干扰后两个基质蛋白基因在外套膜中的表达量。结果显示,hic24和Hc-temptin基因在外套膜中的表达量都显著下降,在扫描电镜观察下,hic24基因对珍珠层文石片的形态、数量以及晶体成核产生了影响,而棱柱层的结构无明显变化,推测hic24基因参与珍珠层成核以及晶体形态和生长的调节。Hc-temptin基因对贝壳棱柱层与珍珠层结构都产生了影响,推测Hc-temptin基因参与了贝壳棱柱层与珍珠层晶体形态和生长的调节。珍珠在形成过程中经过两个连续阶段:无序沉积和有序沉积。通过插片实验探究两个基质蛋白基因在珍珠形成过程中起到的作用。对两个基质蛋白基因在珍珠囊形成时荧光定量检测结果显示,基质蛋白基因hic24和Hc-temptin在无序沉积阶段时表达量较低,但是在有序沉积阶段表达量都显著提高。推测hic24和Hc-temptin基因在调控珍珠层的生长。通过破壳修复实验研究hic24和Hc-temptin在贝壳矿化过程中的作用。对三角帆蚌贝壳进行破壳处理后进行观察,以及对破壳位置处的外套膜进行荧光定量检测分析。在破壳修复过程中,可以观察到,在破壳处首先形成角质层,然后棱柱层开始堆积生长,最后形成珍珠层。在荧光定量结果显示中,hic24在贝壳棱柱层与珍珠层的生长期间表达量逐渐增加,高于初始时的表达量,推测基质蛋白基因hic24对贝壳棱柱层与珍珠层的生长都起作用。Hc-temptin在贝壳棱柱层的生长期表达量逐渐增加,而在珍珠层生长时的表达量趋于初始时表达量,推测基质蛋白基因Hc-temptin参与了贝壳棱柱层的生长,并与其他基质蛋白共同作用于珍珠层的生长。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

序列,多腺苷酸化信号,信号肽,下划线

-RACE 所的片段拼接得到全长为 756bp 的 hic24 序列（图2-1），根据分析表明，序列包含一个 654bp 的开放阅读框（ORF），从第 33 位 ATG密码子开始，在第 686 位的 TAA 密码子处终止，编码 217 个氨基酸。根据软件预测 hic24 的含有一个长度为 18 个氨基酸的信号肽，理论分子量为 23.5kDa，等电点为 6.36。在去掉信号肽，再次检测理论分子量为 21.7kDa

氨基酸序列,多腺苷酸化信号,下划线,信号肽

2-2：Hc-temptin 基因及氨基酸序列，下划线为信号肽，（AATATA）为多腺苷酸化信号ig.2-2: Hc-temptin gene and amino acid sequence. Underlined for the signal peptide, (AATATA)the polyadenylation signal.用 bioedit 软件对基质蛋白基因 Hc-temptin 与双脐螺（Biomphalaria glabrata洲牡蛎（Crassostrea virginica）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）、长牡Crassostrea gigas）、海蜗牛（Aplysia californica）、福寿螺（Pomacea canaliculata基质蛋白基因进行多重比对分析，结果显示，Hc-temptin 与双壳贝类有着较高似度（图 2-3）。

【参考文献】