鳗鲡嗜水气单胞菌OMP免疫原性及其免疫球蛋白抗体的研究

发布时间：2020-07-03 08:51

【摘要】：通过分子生物学方法对鳗鲡常见病原菌嗜水气单胞菌OMP进行克隆与表达,制备基因工程疫苗,研究其对鳗鲡的免疫保护作用,同时通过重组表达的OMP从鳗鲡噬菌体抗体库中筛选出特异性单链抗体,获得其编码基因序列,实现在大肠杆菌和酵母菌中的高效表达,并对其表达产物的生物学活性进行检测与分析。以上研究将为养殖鳗鲡病害的免疫学防治奠定分子基础。主要研究结果如下:(1)以实验室保存的嗜水气单胞菌(B11)外膜蛋白基因质粒为模板,通过克隆、连接、测序后得到重组表达载体pGEX-4T-2-OMP,转化大肠杆菌BL21后经1 mM的IPTG诱导获得分子量约为45 KD的目的蛋白。重组OMP经纯化、冻干、PBS溶解后注射免疫欧洲鳗鲡,同时设有嗜水气单胞菌灭活组和PBS对照组。通过检测14 d、21 d、28 d和42d欧洲鳗鲡不同组织溶菌酶活性、血清抗体水平、以及淋巴细胞转化水平对机体免疫水平进行评价,同时在28 d进行多种鳗鲡致病菌的攻毒试验,对重组OMP免疫保护作用进行研究。结果表明:OMP免疫组和嗜水气单胞菌灭活组均能引起鱼类的非特异性免疫应答反应,溶菌酶含量在21 d或28 d达到高峰;OMP组全血细胞的转化水平在21 d时达到峰值,刺激指数显著高于对照组和嗜水气单胞菌灭活组(P0.05);OMP组与嗜水气单胞菌灭活组的抗体效价均在28 d达到高峰,且显著高于PBS对照组(P0.05);攻毒试验结果表明重组OMP和嗜水气单胞菌灭活菌苗对5种不同的嗜水气单胞菌菌株均有不同程度的免疫保护作用,保护率均高于PBS对照组。(2)将重组OMP作为抗原对噬菌体抗体库T7-Scfv进行淘洗,得到的10株抗体噬菌斑,ELISA阻断实验结果表明其抗体活性分别为68.2%、71.7%、77.7%、77.5%、81.7%、78.4%、77.7%、72.6%、72.8%、68.4%。提取噬菌斑基因组,分别对其编码基因进行PCR和测序分析,选择抗体活性最高的单链抗体基因,命名为OMP-Scfv。(3)以OMP-Scfv基因序列为模板,构建pGEX-4T-2-Scfv原核表达载体和酵母pPIC9K-Scfv真核表达的载体,转化BL21和酵母菌GS115,分别用IPTG和甲醇作为诱导剂进行诱导表达。获得大肠杆菌表达产物为约53 KD(其中目的蛋白约27 KD,GST标签约26 KD),酵母菌表达产物约为27 KD的目的蛋白。并对其表达产物的生物学活性进行检测与分析。综上所述,本实验获得的重组OMP具有较强的免疫原性,对多种不同嗜水气单胞菌菌株均有良好的免疫保护作用;通过噬菌体抗体库T7-Scfv筛选到抗重组OMP的特异性单链抗体,并实现了在大肠杆菌和酵母菌的表达,表达产物生物学活性进行检测后,为其在鳗鲡细菌性疾病防治中的应用提供了基础。
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【图文】：

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鲡嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因扩增：M 为 Marker，1 和 2 为目的基因长约 1200体使用试剂盒进行连接后，提取连=1.95，使用 BamHⅠ与 NotⅠ快切切，如图 2-2。

电泳图,电泳,表达载体,快切

-1 鳗鲡嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因扩增电泳注：M 为 Marker，1 和 2 为目的基因长约 1200 bp 载体使用试剂盒进行连接后，提取连接80=1.95，使用 BamHⅠ与 NotⅠ快切酶酶切，如图 2-2。

【参考文献】