fus在斑马鱼生长发育中的功能研究

发布时间：2020-07-09 22:15

【摘要】：随着生物基础研究的深入,对基因的功能探究一向是生命科学研究的重要课题之一,不单单是在了解生物发育的现象上具有重要的理论意义,也会影响到生产实践的应用。脂肪肉瘤转运/肉瘤融合蛋白(Fus)是一种参与转录调控与前体mRNA剪切的一种RNA结合蛋白。据先前的实验报道,在哺乳动物中突变FUS会导致神经退行性疾病,包括肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)。然而,关于fus的功能在鱼类中的报道却很少。本研究中,我们以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物,探究fus在鱼类中的功能。斑马鱼fus定位于第3号染色体上,由14059 bp个碱基组成,cDNA长度为1626 bp,共编码541个氨基酸,其编码序列包含RNA超家族识别结构域(RRM superfamily)和锌指家族与包含锌指区的RNA结合蛋白结构(ZnF_-RBZ)的两个结构域。基于该基因的功能结构域,我们选取基因组上尽量靠近翻译起始密码子的合适的靶位点,利用近年来广泛使用的CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中对fus产生可遗传的等位基因移码突变,通过子代杂交的方式获得纯合的fus突变体。研究结果发现,在斑马鱼幼鱼与成鱼躯体的发育过程中,通过测量fus~(-/-)纯合突变体与对照组的体长与体重,相对于对照组(wide type,WT)野生型斑马鱼来看,发现突变体斑马鱼的体长与体重均有显著减小,但身体发育却无明显异常并且完全可育。除此之外,在野生型斑马鱼中常见的雌鱼身体比例大于雄鱼的性别异形现象在fus~(-/-)纯合突变体中被消除了。进一步研究生长发育信号通路中较为关键的几种生长相关基因,发现gh1,ghra,igf1,igf2a,stat5.1和socs6基因的表达水平在突变体斑马鱼的早期幼鱼发育阶段显著低于野生型斑马鱼。然而,相对于WT,在fus~(-/-)纯合突变体斑马鱼中,其运动能力并未受到影响。本研究表明,不同于它在哺乳动物中的功能,fus在斑马鱼中与运动神经元的发育不相关但在调节鱼类躯体生长发育与两性生长异形方面有着不同的功能。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

结合蛋白,结构域,锌指结构域,华中农业大学

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位论文蛋白与 mRNA 通过有限的模式化的 RNA 结合结构域（RBDs）相构的不同排列呈现的这些 RBD 的多个拷贝来扩增底物的结构多蛋白质的功能。其中包括 RNA 识别结构域（RRM），异质核 RKH），锌指结构域（Znf）等等（Lunde et al 2007）。常见的 RNA别 RNA 如图 1-1（Fig.1-1）所示。

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30图 3-1 斑马鱼 fus 的时空表达（A）斑马鱼胚胎发育各时期 fus 的表达；（B）斑马鱼各组织 fus 的表达Fig. 3-1 Space-time expression of zebrafish fus(A) Expression of fus during embryonic development; (B) Diffferent tissue expression of zebrafish fus3.3 斑马鱼 fus CRISPR/Cas9 系统构建3.3.1 斑马鱼 fus CRISPR/Cas9 敲除靶位点的设计根据 Ensembl 中斑马鱼 fus 的信息（ENSDARG00000037968），本试验选择斑马鱼最完整的转录本来作为 CDS 序列通过 CRISPR/Cas9 进行靶位点的筛选。依照CRISPR/Cas9 基因靶位点的设计原则，选择靶位点的序列为：

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fus 在斑马鱼生长发育中的功能研究ATGGAGGACAGTC。将选取的靶位点在 Ensembl 数据库与斑马，显示靶位点位于斑马鱼 3 号染色体 fus 上（图 3-2A 和图 3-2B组上特异性较高。选取的靶位点在 CDS 序列上对应的位置为 4应在第 14-21 个氨基酸上，位于 RRM 结构域与锌指结构域之前as9 基因敲除靶位点设计的基本要求。A

【参考文献】