凡纳滨对虾肠道黏膜屏障对黄曲霉毒素B1和副溶血弧菌E1的响应

发布时间：2020-07-11 05:31

【摘要】：为探究凡纳滨对虾肠道黏膜的屏障作用,分别利用黄曲霉毒素B1(AFB1)和副溶血弧菌E1(VPE1)对凡纳滨对虾进行攻毒实验,从组织学及基因表达层面探究凡纳滨对虾肠道对毒素及弧菌的响应机制,以期为对虾的健康养殖、疾病防治提供理论依据。为探究AFB1对凡纳滨对虾肠道黏膜屏障的影响,以投喂含有15 mg/kg AFB1饲料的凡纳滨对虾作为实验组,不含AFB1饲料投喂的凡纳滨对虾作为对照组,分别于第2、4、8、12 d取肠道组织,采用实时荧光定量PCR检测mTOR信号通路中的真核细胞起始因子4E结合蛋白(eif4ebp),真核翻译起始因子1a(eif4e1a),真核翻译起始因子2(eif4e2)和核糖体s6蛋白激酶(p70s6k)基因,与免疫相关的转录因子Dorsal和Relish基因,酚氧化酶原(proPO)基因以及黏蛋白样围食膜因子(mucin-like PM)基因表达水平的变化,利用组织切片技术探究AFB1对肠道组织形态的影响。结果表明,AFB1的添加会对mTOR通路相关基因的表达产生影响,实验组对虾eif4ebp基因自第2 d起发生显著上调;eif4e2和eif4e1a基因皆在第8 d和第12 d被显著抑制;p70s6k基因在第2 d和第4 d呈现下调趋势,并于第12 d回升至初始水平。AFB1同时也刺激了免疫系统的响应,实验组Dorsal基因和Relish基因均被显著诱导;proPO基因于第4 d和第8 d显著上调并于第12 d回落至初始水平;mucin-like PM基因在第2-8 d均显著上调。AFB1的添加也破坏了凡纳滨对虾肠道正常的组织形态,出现上皮细胞核肥大,边缘模糊,上皮细胞层部分脱落等现象。结果表明,AFB1严重影响凡纳滨对虾肠道黏膜屏障的功能,不仅对肠道黏膜造成了机械损伤,同时对肠道化学屏障和免疫屏障产生了影响。利用转录组测序(RNAseq)技术及生物信息学分析,探究了VPE1感染12 h时凡纳滨对虾肠道中与肠道黏膜屏障功能相关的基因转录水平的变化,结果表明:(1)转录组测序原始数据经过质控、拼接后,共得到164,420条Unigene,将Unigene与Nr,Nt等7大数据库进行比对,共有48542条Unigene注释到至少一个数据库中,占全部Unigene的29.52%;(2)利用DEseq进行差异表达分析,得到差异表达的基因(Differentially expressed genes,DEGs)共4646个,其中上调的基因有2469个,下调的基因有2177个;(3)从DEGs中鉴别出可能参与到凡纳滨对虾肠道黏膜屏障对VPE1感染响应过程的基因,涉及到肠道黏膜的机械屏障、化学屏障和免疫屏障的相关功能,包括:围食膜因子,细胞骨架和细胞连接,模式识别受体,抗菌肽与免疫信号通路,丝氨酸蛋白酶/蛋白酶抑制剂与酚氧化酶系统,细胞凋亡与细胞吞噬,抗氧化系统等功能。(4)利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法对15个DEGs进行验证,验证结果与转录组结果一致。利用组织切片和透射电镜观察VPE1浸浴后凡纳滨对虾肠道组织与细胞形态结构的变化。结果表明:(1)VPE1感染后,肠道上皮细胞层结构被破坏,上皮细胞层与基膜分离;(2)透射电镜结果表明,VPE1感染后,肠道上皮细胞的结构发生变化,细胞连接被破坏,细胞间界限模糊;部分细胞的细胞核固缩,异染色质聚集在核膜内围,溶酶体出现在细胞核附近;部分细胞微绒毛脱落,细菌进入细胞内部并被囊泡包裹,细胞内部出现空洞,有凋亡小体出现。同时电镜观察结果在一定程度上与RNAseq差异表达基因的结果相互印证。转录组、组织切片与电镜结果表明,机械、化学及免疫屏障参与到凡纳滨对虾肠道对VPE1感染的响应过程中,在凡纳滨对虾肠道抵御弧菌感染的过程中发挥重要作用。上述结果有助于理解凡纳滨对虾肠道对弧菌及毒素的响应机制,可为对虾肠道黏膜屏障研究提供理论依据,所获得的大量转录本可为未来对虾基因组学的研究提供参考,为新基因的发现提供丰富的数据资源。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S945.49
【图文】：

肠道,基因表达,基因,显著性差异

图 2.1 饲料中添加 AFB1 对凡纳滨对虾肠道四种营养相关基因表达的影响（a）eif4ebp,（b）eif4e1a,（c）eif4e2,（d）p70s6k；不同字母代表在不同时间点之间基因存在显著性差异，*代表同一时间点实验组与对照组存在显著性差异（P<0.05）。Fig. 2.1 The effects ofAFB1 on the transcription level of 4 genes related to nutrition in themidguts of L.vannamei（a）eif4ebp,（b）eif4e1a,（c）eif4e2,（d）p70s6k；Bars with different letters above them aresignificantly different at P<0.05；* indicate significant differences between the controlgroup and the experimental group at each time point（P<0.05）.Dorsal 及 Relish 两种免疫相关基因在投喂 AFB1 后的对虾肠道中均呈现显著的上调。Dorsal 基因从第 2 d 起呈现上调趋势，并于第 4 d 相对表达量达到最高，第 12d 降至初始水平（P<0.05）（图 2.2-a）。Relish 基因自第 2d 起被显著诱导并达到最高，此后上调程度逐渐降低，有回落的趋势，于第

肠道,基膜,显著性差异,实验组

图 2.2 饲料中添加 AFB1 对凡纳滨对虾肠道四种免疫相关基因表达的影响（a）Dorsal,（b）Relish,（c）proPO,（d）mucin-like PM；不同字母代表在不同时间点之间基因存在显著性差异，*代表同一时间点实验组与对照组存在显著性差异（P<0.05）。Fig. 2.2 The effects ofAFB1 on the transcription level of 4 genes related to immunology in themidguts of L.vannamei（a）Dorsal,（b）Relish,（c）proPO,（d）mucin-like PM；Bars with different letters abovethem are significantly different at P<0.05；* indicate significant differences between thecontrol group and the experimental group at each time point（P<0.05）.2.3.3 凡纳滨对虾肠道组织形态学分析对照组肠道上皮细胞排列紧密，与基膜紧密相连，细胞核边缘清晰，内壁向肠腔内凸起形成褶皱（图 2.3-1,2）。实验组第 2 d 肠道组织形态并未发生明显变化，上皮细胞层完整，并未与基膜分离，细胞间隙较为清晰（图 2.3-

饲料质量,基膜,疾病,样品

图 2.3 凡纳滨对虾肠道组织切片Fig. 2.3 Histological examination of L.vannamei midguts注：1,2 代表对照组肠道组织样品；3,4,5,6 分别代表第 2,4,8,12 d 肠道组织样品。其中 IEC代表肠道上皮细胞层，BM 代表基膜，CM 代表环肌层。Notes：Histological examination of 1,2 indicates the midgut of shrimp in control group; 3,4,5,6indicates the damage in midgut of shrimps fed withAFB1 containing diet at 2,4,8,12drespectively. Letters indicate different structures: IEC represents intestinal epithelial cells,BM represents basement membrane, CM represents circular muscle.2.4 讨论对虾肠道疾病严重制约着对虾养殖业的发展，而饲料质量是影响对虾肠道健康的重要因素之一，因此研究 AFB1 对凡纳滨对虾肠道黏膜屏障的影响有着重要的意义。

【参考文献】