草鱼p53介导的NF-κB与PKR的转录调控分析

发布时间：2020-07-13 16:55

【摘要】：p53,是一种重要的肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene),同时也是一种重要的转录调控因子,其通过调控一系列不同的靶基因来发挥其不同的生理功能,如诱导细胞凋亡、参与细胞周期调控以及抗病毒反应等。NF-κB是一种重要的转录因子,能够调节一系列基因表达参与细胞增殖分化、炎症反应、先天免疫以及凋亡等生理过程。PKR是先天免疫抗病毒信号通路中一种重要的效应蛋白,且作用机制研究的比较透彻。鱼类p53在先天免疫中的作用也逐渐被报道。但对于p53与NF-κB、PKR之间的相关研究报道甚少。因此,本文主要为了研究p53所介导的NF-κB/PKR两者之间的转录调控机制,从而进一步表明p53在鱼类先天免疫反应的重要地位。为了研究草鱼(Ctenopharyngodon idella)p53(Cip53)在先天免疫信号通路中的转录调控机制,我们首先克隆与鉴定了草鱼p53基因的全长cDNA序列(KX871190)及其启动子序列。Cip53全长cDNA为1879bp,包括1个146bp的5'非翻译区、1个617bp的3'非翻译区和1个编码371个氨基酸的1116bp的开放阅读框;Cip53蛋白结构包含一个DNA结合区域与位于C端的寡聚化区域。Cip53启动子为距离转录起始位点上游991bp的序列,其中包括Rel-A、IRF3、XBP-1及p53潜在调控位点。通过荧光定量PCR实验,我们分析了在poly I:C刺激之后p53在草鱼不同组织以及草鱼肾细胞(CIK)中的表达特征。实验结果表明Cip53在草鱼所测各个组织(脑、眼、皮、鳃、脾、肾)中,在6h与24h、48h均出现表达上调;且在CIK细胞中刺激6h后出现大幅度上调。另外,通过体外非放射性凝胶阻滞实验分析了Cip65蛋白与Cip53启动子的亲和性以及Cip53蛋白与Ci PKR启动子的亲和性,结果分别表明Cip65能够明显阻滞Cip53启动子片段迁移,且Cip53能够明显阻滞Ci PKR启动子片段迁移。说明Cip53能够被Cip65所调控,且Cip53是CiPKR潜在的转录调控因子。本研究还通过构建了真核表达载体pCDNA3.1-Cip65与pGL-Cip53启动子报告载体以及pCDNA3.1-Cip53与pGL-CiPKR,然后分别瞬时转染于CIK细胞中,双荧光素酶活性实验结果表明Cip65能够激活Cip53的转录且Cip53能够显著激活CiPKR的转录。为了进一步分析Cip53在Cip65与CiPKR之间的转录调控关系,本研究还通过设计了敲降Cip53的si RNA,通过干扰实验结果表明,在Cip53在转录水平被显著敲低后,Cip65与CiPKR的转录水平也显著降低。表明p53参与了NF-κB和PKR所介导抗病毒转导途径。综上所述,通过对Cip53在先天免疫信号通路的转录机制分析,体现了Cip53在鱼类抗病毒作用过程的重要地位。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

图 1.1 人 p53 蛋白结构示意图(引自文献[51])Figure 1.1 The structure of human p53 protein p53 的生物学功能

.图 3.1 草鱼 p53 基因 RACEFig. 3.1 Race of Cip53 gene) M：DL5000 分子量标准；1：Cip53 ORF 片段。(B) M：DL5000 分子量标准；1：Cip5'RACE 片段。(C) M：DL5000 分子量标准；1：Cip53 3'RACE 片段。.1.2 草鱼 p53 基因序列分析

30图 3.5 草鱼 p53 基因的定量表达分析Figure 3.5 Quantitative Expression Analysis of Cip53(A) poly I:C 刺激后草鱼 p53 基因的组织表达。经 poly I:C 刺激后的草鱼各组织(脑、眼、皮、鳃、脾、肾)，qRT-PCR检测草鱼 p53在各组织中的表达量。以 0h眼的 Cip53相对于内参β-acti的表达量值设为 1 作为对照；实验数据为三次独立重复实验的平均值。(B) poly I:C 刺激后草鱼 p53 基因在 CIK 细胞中的表达。CIK 经 10μL poly I:C(1mg/mL)刺激后，qRT-PCR 检测在不同时间点(0h，6h，12h，24h，48h，72h)的 Cip53mRNA 的表达量。实验数据为三次独立重复实验的平均值。*表示差异显着(p <0.05)，**表示极显着性差异(p <0.01)。poly I:C 刺激 CIK 细胞后，qRT-PCR 结果显示 Cip53 的表达水平提高，刺激6h 后表达量增高，持续在 12h 达到峰值后到 72h 逐渐回落 (图 3.5 B)。3.4 草鱼 p65 与 p53 的启动子及草鱼 p53 与 PKR 的启动子亲和性分析3.4.1 草鱼 p65 与 p53 启动子的非放射性凝胶阻滞分析由实验室保存的 Cip65 以及 Cip65- N 与 Cip65- C 的蛋白(图 3.6 A)，通过

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本文编号：2753726