无乳链球菌α-enolase，PGK和GAPDH基因的克

发布时间：2020-07-18 01:13

【摘要】：在中国南方,罗非鱼是主要的淡水养殖品种。近年来,由无乳链球菌引起的链球菌病在一定程度上制约了罗非鱼产业的健康发展。无乳链球菌自身具有一定抗药性,安全有效的抗生素尚未被开发,疫苗的研发成为预控无乳链球菌病的有效方法。在现今,研究无乳链球菌菌株有高效交叉保护性的亚单位疫苗越来越受到重视。本研究是基于国内外对无乳链球菌病有高保护性的无乳链球菌外表面蛋白的研究,克隆并表达了α-enolase,phosphoglycerate kinase(PGK)和Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)三种蛋白。将三种蛋白制备成疫苗免疫罗非鱼,观察对无乳链球菌病的保护效果。主要结果如下:1、经BLAST同源比对和PCR技术,得到α-enolase、PGK和GAPDH三种蛋白基因的ORF全长。α-enolase,全长1308 bp,编码435个氨基酸(amino acid,aa),相对分子量为49.4kDa;PGK,全长1046 bp,编码349 aa,相对分子量为42kDa;GAPDH,全长1011 bp,编码336 aa,41.4kDa。经蛋白质结构分析预测,三种蛋白均无信号肽,α-enolase可能存在跨膜结构域。2、运用原核表达和亲和层析技术,纯化获得α-enolase、PGK、GAPDH重组蛋白。三种重组蛋白均为可溶性表达。分别大量纯化三种重组蛋白,超滤浓缩后保存并用于后续试验。3、制备疫苗,并进行免疫效果评价。免疫罗非鱼,第二周加强免疫后,进行无乳链球菌THN(海南株)攻毒实验。三种蛋白制备的亚单位疫苗分别得到31.70%,28.70%和48.12%的相对保护率。将α-enolase,PGK和GAPDH重组蛋白分别与灭活全菌混合后制得疫苗,在加强免疫后第二周进行无乳链球菌THN(海南株)攻毒,分别得到86.23%,68.67%和71.35%的相对保护率。运用ELISA实验对免疫后的鱼血清中的抗体滴度进行了检测,分析结果显示抗体滴度显著提高。本研究结果显示无乳链球菌α-enolase,PGK和GAPDH蛋白具有一定的免疫原性,可作为罗非鱼链球菌亚单位疫苗的候选基因或提高全菌灭活疫苗免疫保护效果的添加物。
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;S943
【图文】：

图谱,试剂盒,公司,试剂

图 2-1 pMD-19T 的图谱和序列Fig. 2-1 The map and sequence of pMD-19T vector2. 1. 3 药品及试剂1. 日本 Takara 公司: 限制性快速内切酶 Quick cut BamHI 、Quick cut HindIII、Quick cut EcoRI、Quick cut XhoI 和 Quick cut NdeI；rTaq polymerase premix、ExTaqpolymerase、DL2,000 DNA ladder Marker；2. 北京普博欣公司：蛋白胨，酵母提取液，氨苄霉素，卡那霉素；3. 中国碧云天公司：Super-competent Cell Preparation Kit 细菌超级感受态制备试剂盒；4. Omega 公司：E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit 胶回收试剂盒，Plasmid MidiKit 质粒提取试剂盒；2. 1. 4 试剂及培养基的配制

无乳链球菌,DNA提取,菌株,基因

2-2 无乳链球菌 DNA 提取traction of Streptococcus agala 为 DL2,000 marker； 1-4：APDH 基因 PCR 扩增结N 菌株DNA 为模板，以置 (图 2-3)。

无乳链球菌,特异性引物

图 2-2 无乳链球菌 DNA 提取Fig. 2-2 Extraction of Streptococcus agalactiae DNA注：M 为 DL2,000 marker； 1-4：DNA. 2 α-enolase，PGK 和 GAPDH 基因 PCR 扩增结果以提取的无乳链球菌THN 菌株DNA 为模板，以设计的特异性引物来扩R 产物条带大小在预期位置 (图 2-3)。

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