【摘要】：刺参生长面临的主要环境应激因素主要有温度、盐度、溶氧、感染、干露等过强的刺激会引起刺参机体免疫能力的下降、摄食能力减弱、生长速度减缓、排脏、暴发疾病等。但是现阶段较为粗犷的室外池塘养殖方式,夏季高温天气、河口区域淡水注入、水体污染造成的细菌感染、以及刺参运输中受到干露刺激,在生产过程中都是无法避免的。本实验对3个刺参不同群体进行比较,每个品系又分为大、小2种规格。小规格刺参重量为49.72±6.53 g,大规格刺参重量在97.58±18.12 g左右。在实验室中模拟这四种引起刺参应激的因素,通过胁迫的实验方法来评价三个刺参群体的不同规格实验组的抗逆能力。也结合刺参生长率、死亡率和测定免疫酶活性的方式来评价”高抗1号”新品系刺参、非选育刺参1和非选育2三个刺参群体的经济性状。实验结果为,在高温胁迫实验和低盐胁迫实验中,”高抗1号”新品系刺参都有良好表现,成活率高、特定生长率较大、非特异性免疫酶活力较高等,特别是在高温胁迫方面,“高抗1号”新品系刺参具有良好的抗高温性状。为研究周年水温变化对“高抗1号”新品系刺参刺参活动状态和生理生化的影响,对6个刺参养殖池塘进行为期一年的跟踪,观察记录其摄食、排便、活动轨迹,在水温升高至刺参夏眠节点进行肠道取样测量消化酶(蛋白酶、淀粉酶、和脂肪酶)活性并且固定肠道样品、制作石蜡切片。研究结果显示,“高抗1号”新品系刺参较非选育刺参,有显著的耐高温性状:夏眠期缩短约一个月。在水温升至的28℃时,消化道中蛋白酶、淀粉酶活力较高,差异显著;脂肪酶不同温度下其活力都很低,无显著差异。本实验根据之前学者研究的关于刺参高温环境应答的基因入手,从基因组学的角度出发,采用实时荧光定量PCR技术,对温度提高过程下刺参基因转录mRNA量的变化进行测定。筛选出4种与热应激表达有关基因,类致死必需蛋白基因、热休克蛋白基因、主要卵黄蛋白基因和前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因。以β-actin为内参,利用相对定量2-ΔΔct法,对这4个基因在不同温度胁迫下的相对表达量进行研究。本实验对实验所用的刺参进行高温胁迫后,hsp70和l(2)efl相对表达量上升,再次证明了hsp70和l(2)efl为上调基因,当水温为27-30℃时,hsp70和l(2)efl随着温度的升高其表达量增多,刺参耐热性通过hsp70的表达来实现。在水温为28℃高温胁迫时,hsp70和l(2)efl的上调表达明显。进行高温胁迫之后myp和psck9相对表达量总体呈下降趋势,myp和psck9为下调基因。水温有27℃升至28℃时,myp和psck9相对表达量下降显著。在各个高温胁迫时,“高抗1号”新品系刺参的四种热应激相关基因的表达水平与其它品系刺参存在差异。微卫星标记以实验提取的dna为模板,和实验室现有的64对引物进行pcr扩增,扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,根据条带的有无筛选出符合条件的微卫星dna引物。popgene32.0软件统计分析每一个位点的等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、基因流(nm)、香农-威纳指数(i)、hardy-weinberg平衡检验、群体间遗传分化指数(fst)和nei’s标准遗传距离(ds);genepop软件进行连锁不平衡检验;piccalc0.6计算每个位点的多态信息含量(pic);利用mega6.0绘制聚类分析图。3个养殖群体刺参平均等位基因数、平均有效基因数均以gk群体刺参最高,分别为10和4.7070;ns2和ns1群体的等位基因都为9,ns1和ns2刺参品系的平均有效等位基因数分别为4.5260和4.1618。gk个体刺参期望杂合度和观测杂合度最高,分别为0.7197和0.4714;ns2群体刺参的观测杂合度最低,为0.4555,期望杂合度为0.6789。3个养殖群体刺参的多态信息含量(pic)分别为0.6828,0.6386和0.6691;其中gk群体刺参pic最大,为0.6828,ns1群体刺参次之,为0.6691,ns2群体刺参最小,为0.6386。3个养殖群体的近交系数fis值分别为0.3760、0.2698和0.3094,均大于0。fis值表示近交系数,当fis0表明群体杂合子过剩,当fis0表明群体杂合子缺失,当fis=1时表明群体观测杂合子完全缺失。实验结果表明3个刺参养殖群体均存在一定程度的杂合子缺失现象;13个位点中3个群体杂合子缺失位点数分别为:12,9和11个。三个刺参群体两两之间的遗传分化指数介于0.0141~0.0593之间,其中gk和ns2群体之间的遗传分化指数最小(0.0141),NS2和NS1之间的遗传分化指数最大(0.0593),GK与NS1群体代之间遗传分化指数为0.0432。三个刺参群体两两之间的Nm值介于3.9629~17.5212之间,其中NS2与GK群体之间基因流最大(17.5212),NS2与NS1群体之间基因流最小(3.9629),GK与NS1群体代之间基因流为5.539。3个刺参养殖群体间的遗传距离为0.0628~0.3166,遗传相似指数为0.7286~0.9391。其中NS2与GK群体之间的遗传距离最近,为0.0628,遗传相似指数最高为0.9391;NS2与NS1群体之间的遗传距离最远,为0.3166,遗传相似指数最低,为0.7286。NS2与GK群体代遗传距离最近,首先聚为一支,由于NS1群体与其它2个群体遗传距离相对较远,FNS1和GK群体个世代最后与NS1代聚为一支。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【图文】：
实验布局
实验布局
实验布局
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