抗生素对鳗弧菌T6SS表达的影响及鳗弧菌毒力相关基因的筛选

发布时间：2020-08-04 14:35

【摘要】：鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是水产养殖中常见的条件致病菌之一,广泛存在于海洋环境中,可感染鱼、虾、贝等多种水产动物,引起的出血性败血症对水产养殖业造成重大经济损失。VI型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)广泛分布于革兰氏阴性细菌中,具有提高病原菌的毒力、种间或种内竞争、与宿主互惠共生、应对外界环境变化等功能。我们在前期研究中发现鳗弧菌M3株的T6SS不表达,即使改变多种培养条件和环境因子也未能激活T6SS。为了寻找影响鳗弧菌T6SS表达的因子,本文分析了几种抗生素对M3 T6SS表达的影响,并构建M3突变体库来筛选影响T6SS表达的因子。但是这两种方法均未能成功筛选到激活M3 T6SS的因子。于是基于该突变文库,开展了影响鳗弧菌几种毒力表型的基因的筛选。具体研究内容如下:1.抗生素对鳗弧菌M3和MHK3T6SS表达的影响。鳗弧菌MHK3的T6SS处于激活状态,特征为能够表达和分泌溶血素共调节蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp),用作阳性对照菌株。本研究构建了鳗弧菌融合菌株M3 lacZ::T6SS和MHK3 lacZ::T6SS,在抗生素胁迫下检测鳗弧菌T6SS的表达变化。结果显示,在不同浓度的四环素、链霉素、罗红霉素、多粘菌素的作用下,鳗弧菌MHK3的生长在对数生长期受到抑制(p0.05),但在平台生长期恢复了正常生长(p0.05);与此同时,在整个生长期间,鳗弧菌T6SS的表达均受到显著性抑制(p0.05)。鳗弧菌M3在抗生素的胁迫下T6SS依旧未检测到表达。这些结果表明四环素、链霉素、罗红霉素、多粘菌素等抗生素的作用可以降低鳗弧菌MHK3 T6SS的表达,但不能诱导M3 T6SS的表达。2.鳗弧菌M3转座子突变体文库的构建和Hcp表达菌株的筛选。使用转座子mini-Tn10(pLOF/Kana),利用电激转化和细菌结合的方法,构建了鳗弧菌M3菌株转座子突变体文库,共得到突变株1152株。利用RT-PCR和Westernblot的方法检测突变文库菌株hcp基因的转录和表达情况。研究结果显示,筛选到1株突变株2B_5的hcp基因转录水平比野生型M3菌株提高40倍,但未能检测到该突变株表达Hcp蛋白。3.鳗弧菌M3毒力相关表型发生变化的突变株及基因的筛选。对M3突变体文库的1152株菌进行筛选,得到泳动、酪蛋白酶活性、明胶酶活性、菌膜形成能力发生明显变化的突变株1株(菌株6G_1)、3株(5A_11,7B_12,7E_12,)、1株(7H_1)、3株(5E_2、6A_2、6E_12)。进一步分析显示,一个磷酸二酯酶相关基因的突变引起泳动能力增强(P0.05),leuD、rseB和thiQ的突变引起酪蛋白酶活性明显减弱(P0.05),potD的突变引起明胶蛋白酶活性显著减弱(P0.05),leuO、ilvH和grpB的突变引起菌膜形成能力明显减弱(P0.05)。综上所述,本研究从环境和基因水平未能找到激活鳗弧菌M3 T6SS的因子,找到8个影响鳗弧菌M3运动、蛋白酶活性、菌膜形成等毒力相关的基因,为进一步研究鳗弧菌的致病机制奠定了基础。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.4
【图文】：

15C D 4-1 鳗弧菌 MHK3 lacZ::T6SS 和 M3 lacZ::T6SS 融合菌株的构 4-1 Construction of fusion strain MHK3 lacZ::T6SS and M3 lacZ::TMHK3 T6SS 基因簇同源臂 DNA。M: DNA 2k plusΙΙ Marker；1 和组 DNA 为模板扩增得到的 DNA 条带，示扩增 DNA 大小为 119 MHK3 lacZ::T6SS。M: DNA 2k plusΙΙ Marker；1 和 2，以 MHK3模板扩增得到的 DNA 条带，示扩增 DNA 大小为 1033bp。

18图 4-2 鳗弧菌 MHK3 lacZ::T6SS 在不同抗生素浓度胁迫下的生长柱状图中不同的字母表示差异显著（p < 0.05）Fig 4-2 Growth of V. anguillarum MHK3 lacZ::T6SS under different concentrations of variousantibiotics

图 4-2 鳗弧菌 M3 lacZ::T6SS 在不同抗生素浓度胁迫下的生长柱状图中不同的字母表示差异显著（p < 0.05）Fig 4-2 Growth of V. anguillarum M3 lacZ::T6SS under different concentrations of variousantibiotics2.3.3M3 和 MHK3 的 T6SS 在抗生素胁迫下的表达在上述不同抗生素抑制鳗弧菌生长的情况下，我们检测了 MHK3 lacZ::T6SS和 M3 lacZ::T6SS 的β-半乳糖苷酶活性，以明确抗生素胁迫是否影响鳗弧菌 T6SS的表达。结果显示，四环素、链霉素、罗红霉素、多粘菌素的胁迫影响了MHK3T6SS 的表达，而 M3 在上述抗生素作用下 T6SS 均无检测到β-半乳糖苷酶活性，在这些抗生素作用下无法激活 T6SS 功能。在没有抗生素作用下， MHK3T6SS 在对数生长期的表达（2-12h）的表达逐渐升高，在平台期（12-24h）的表达维持较低水平。在抗生素胁迫下，MHK3 T6SS 的表达在整个生长期间显著下降（p<0.05）；胁迫浓度越大，MHK3 T6SS 的表达水平下降越明显，当四环素浓度为 1.0 μg/mL、链霉素为 10-15 μg/mL、罗红霉素在 10-30 μg/mL、多粘菌素

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本文编号：2780682