大黄素对团头鲂代谢、免疫及抗氧化调节作用的差异蛋白质组学研究

发布时间：2020-08-04 20:55

【摘要】：在水产养殖过程中,鱼类经常会受到各种来自外界的不良应激,导致鱼体生长受阻,严重时会导致鱼病爆发,甚至死亡,影响了水产食品安全以及水产养殖业的发展。因此,提高鱼体免疫力、减少病害已是大家关注的热点。大黄素是中草药大黄的主要提取成分之一,具有抗菌、抗病毒、抗应激、增强免疫力、诱食、营养以及改善水质等多重功效。作为免疫增强剂,中草药没有抗生素和化学药品存在的耐药性等弊端,既能防治水产动物病害,又能够作为营养素促进消化吸收和生长,成为抗生素、激素和其他化学药品替代研究的热点,已被广泛应用于人类疾病防控以及养殖业。团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的淡水养殖品种,鉴于养殖过程中的疾病易爆发等问题,本研究旨在通过蛋白质组学的研究方法确定饲料中添加大黄素对团头鲂肝脏差异蛋白质组的影响,了解代谢、抗氧化及免疫相关差异表达蛋白的相互作用机制,为大黄素在团头鲂养殖中的应用提供理论依据。主要研究内容如下:1日粮添加大黄素的团头鲂肝脏差异蛋白质组分析本实验旨在利用基于双向电泳的蛋白质组学方法分离并鉴定饲料中添加30 mg/kg大黄素后团头鲂肝脏的差异表达蛋白。结果显示,以表达丰度差异2倍以上为基准,共分离得到团头鲂肝脏差异表达蛋白质点39个,成功鉴定38个,其中表达上调蛋白质点8个,表达下调蛋白质点30个,共包括25种不同蛋白质。依据GO数据库的生物功能注释,以蛋白质参与的生物学过程和分子功能为依据,分离的差异蛋白质点可以分为十类,包括糖代谢蛋白12个(8种,占31%),能量代谢蛋白8个(3种,占20%),免疫相关蛋白1个(1种,占2%),细胞骨架蛋白4个(2种,占10%),伴侣蛋白2个(2种,占5%),信号转导蛋白1个(1种,占3%),抗氧化蛋白5个(2种,占13%),辅酶因子和维生素蛋白1个(1种,占3%),氨基酸代谢蛋白3个(3种,占5%),核苷酸代谢蛋白2个(2种,占8%)。2差异表达蛋白的互作网络分析及基因功能注释本实验旨在利用NCBI、STRING、DAVID、GO等数据库的相关数据,通过Cytoscape软件构建团头鲂肝脏差异表达蛋白的互作网络模型,并对差异表达蛋白基因进行功能注释。结果显示,在25种差异表达的蛋白中,有18种在机体的互作调控网络中起重要作用,分别为ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST、HSP70、Bhmt1、EEF2b、FTCD、Aldh8a1、Aldh9a1a、LDHBB、Eno3、Pgk1、ME1、ETFA 和AST。其中ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST和HSP70在大黄素对团头鲂的抗氧化应答过程中扮演重要角色,且除ALDOB和TP53外均表达上调。差异表达蛋白基因的GO功能注释结果表明,差异表达蛋白基因主要参与机体代谢过程中的氧化还原反应,同时还参与了糖酵解、葡萄糖分解、单糖分解、己糖分解、乙醇分解、细胞碳水化合物分解等过程。在已经检索到的信息中,TP53、Aldh9a1a、ME1、Aldh8a1、LDHBB、Sord、ALDOB、HSP70和GPx1均参与了氧化代谢过程,与Cytoscape软件的分析结果相吻合,说明 ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST 和 HSP70 蛋白在团头鲂抗氧化代谢中起重要作用。3差异表达蛋白的转录水平表达量验证及功能分析本实验旨在利用RT-PCR技术对差异表达蛋白进行转录水平的表达量验证,并初步探讨代谢、抗氧化及免疫相关蛋白的调控关系。结果表明,30mg/kg大黄素添加组抗氧化相关蛋白ApoA1、ALDOB、GAPDH、HSP70、GPx1和GST的mRNA表达量均显著高于对照组(P0.05)。随着大黄素添加水平的提高,ApoA1、GAPDH、HSP70、GPx1和GST的mRNA相对表达量均呈先升高后降低的趋势,且均在添加量为3Omg/kg时相对表达量最高;30mg/kg大黄素添加组糖代谢蛋白Aldh8a1、Eno3、Pgk1,能量代谢蛋白ETFA，氨基酸代谢蛋白FTCD的mRNA表达量均显著高于对照组(P0.05),而糖代谢蛋白Sord,氨基酸代谢蛋白FAH,核苷酸代谢蛋白EEF2b的表达量显著低于对照组(P0.05)。综合以上所有结果可以表明,饲料中添加30 mg/kg大黄素能够通过复杂的调控网络提高团头鲂的代谢、免疫及抗氧化性能。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S965.119
【图文】：

我们采用Ｖｏｌ邋％邋（占总蛋白含量的百分比）的概念计算每个样品表达量的变化逡逑倍数。为避免系统误差，每个样品至少重复Ｈ次。表达丰度在２倍Ｗ上的视为差异蛋逡逑白，对照组和３０ｍｇ／ｋｇ大黄素添加组团头妨肝脏的表达图谱如图２－１所示，表达有差逡逑异的蛋白质点用绿色标出，并用数字标记对应的鞭向位置。逡逑逦ＩＥＦ邋ｐＨ邋４－７逦＾逡逑巧逡逑塞邋ｒ－＃邋．邋＇邋．邋？？玄来；＊壚题古作逡逑Ｓ邋，逦？，’逦？＂粒？巧己？逡逑，？邋一邋。，｜＾邋？逡逑？！逦？‘逦－’Ｉ逦！邋？邋？逡逑Ｉ逦‘试；、峡逡逑图２－１邋３０邋ｍｇ／ｋｇ大黄素组团头橆肝脂蛋白质双向电泳图谱（ｐＨ邋４－７）逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋２－ＤＥ邋ｍａｐ邋ｉｎ邋ｈｅｐａｒ邋ｏｆ邋Ｍ邋幻啤片ａ／幻邋ｆｆｅｄ邋ｄｉｅｔｓ邋ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋３０邋ｍｇ／ｋｇ邋ｅｍｏｄｉｎ邋（ｐＨ邋４－７）逡逑１９逡逑

将上述获得的全部数据进行整理，删除蛋白质互作对中冗余数据和自作用数据，逡逑将整理后的数据导入Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ软件（Ｖｅｒｓｉｏｎ邋３N１），依据检索数据和差异蛋白的相逡逑对表达量调整相应节点、连线等，构建蛋白质互作网络图，操作界面如图３－１所示。逡逑建立的蛋白质网络互作关系图由节点（Ｎｏｄｅ）和连线（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）构成，互作网络逡逑中的节点代表相互作用的蛋白质，连线代表蛋白质之间的相互作用关系，节点间连线逡逑的粗细代表互作强度的高低。逡逑Ｗ＃邋＇４却邋９巧》知＞巧逦－－裕？逡逑一逦

本文编号：2781067