虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测技术的建立及其与对虾生长相关性的研究
发布时间：2020-08-04 21:01
【摘要】：虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)是近几年新发现的寄生于对虾肝胰腺组织的新病原,2009年泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾首次发现并命名。尽管虾肝肠胞虫不会引起对虾的死亡,但它与对虾生长缓慢有关。早期死亡综合征或者急性肝胰腺坏死病(AHPND/EMS)引起的虾高致死率使得人们将更多的注意力集中到AHPND/EMS上面,忽视了虾肝肠胞虫造成的影响,这使得虾肝肠胞虫的传播越来越广泛,有信息表明在中国、印度尼西亚、马来西亚、越南、印度和泰国中都有检出。本文从实时荧光定量检测方法的建立、人工感染实验、肝肠胞虫的寄生数量与对虾生长相关性几个方面进行研究。根据Genbank中公布的对虾肝肠胞虫SSU r DNA序列设计一对特异性引物,通过对引物的特异性以及灵敏度检测实验表明引物具有良好的特有性和较高的灵敏度。利用p MD18-T构建含有SSU r DNA序列的重组质粒作为实验标准品,对反应体系进行多次优化建立了肝肠胞虫SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,构建的方法扩增循环数与目的基因拷贝数呈良好的线性关系,且Tm值为60℃时扩增效果最好,熔解曲线仅有一个单一的特异峰,扩增所的扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数标的准曲线为Ct=-3.369log(Sq)+39.364,相关系数R2=0.992,扩增效率为98.5%。利用建立的荧光定量方法检测了海南采集的31份个体生长大小不均匀的凡纳滨对虾样品,肝肠胞虫的阳性检出率为67.7%,高于常规PCR检测,而且通过溶解曲线分析特异性良好,表明该方法具备较好的适用性。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,可为肝肠胞虫进行快速检测以及定量研究提供参考。人工感染实验利用凡纳滨对虾幼虾和卤虫进行,用冰冻和鲜活的的感染有肝肠胞虫的凡纳滨对虾肝胰腺组织去投喂健康的凡纳滨对虾,投喂一周后的样品套式PCR检测结果显示投喂冰冻和鲜活肝胰腺组织病料都可以使健康幼虾感染肝肠胞虫。说明肝肠胞虫的孢子能够抵抗较差的外界环境,低温冰冻后仍然具有感染力,这也为生产上肝肠胞虫的预防和治疗带来了麻烦。卤虫感染实验样品套式PCR检测结果显示为阴性,利用实验建立的实时荧光定量PCR方法检测结果显示为阳性。说明肝肠胞虫感染卤虫后并没有在卤虫体内大量繁殖,但是肝肠胞虫可以在卤虫体内寄生存活。在对虾肝肠胞虫的流行病学调查过程中,我们采集了山东即墨、江苏赣榆以及海南儋州三个地区生长缓慢且个体大小差异明显的凡纳滨对虾样品,并测量了这几批凡纳滨对虾的体长,怀疑这几批样品是因为感染对虾肝肠胞虫而导致其生长缓慢,并且出现个体大小差异的明显症状,利用实时荧光定量PCR检测方法分析了肝肠胞虫对这几批凡纳滨对虾样品生长的影响。实验同时对WSSV、IHHNV、CMNV、AHPND四种病原进行PCR检测,检测结果显示这几种病原的检出率很低。Real-time PCR检测肝肠胞虫结果显示海南儋州肝肠胞虫检出率为68%,江苏赣榆和山东即墨样品肝肠胞虫全部为阳性。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的三批凡纳滨对虾共94份的肝胰腺组织DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA进行了实时荧光定量PCR检测,结果表明EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng Hp DNA)时代表了较高的风险水平。本实验建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术和参考。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945.4
【图文】：
除了EHP的常规PCR为阳性的样品有扩增曲线外，其余样品以及阴性对照均没有检测到荧光信号。将实时荧光定量PCR特异性扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2-2），结果显示，只有EHP阳性样品泳道有与目的产物分子量大小一致的产物条带，其余泳道均为阴性，进一步说明所设计的引物的特异性。图2-1 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR引物ENF185和ENR185的扩增曲线Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei图2-2 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR扩增产物的电泳M. DL2000；1. EHP的PCR检测为阳性的凡纳滨对虾样品总DNA；2. WSSV纯病毒基因组EHPOtherpathogens
对虾总DNA、HPV阳性的中国明对虾总DNA、纯化WSSV的核酸、感染副溶血弧菌的凡纳滨对虾总DNA、健康凡纳滨对虾总DNA以及水为模板的空白对照，用引物ENF185和ENR185进行实时荧光定量PCR扩增，其扩增曲线（图2-1）显示，除了EHP的常规PCR为阳性的样品有扩增曲线外，其余样品以及阴性对照均没有检测到荧光信号。将实时荧光定量PCR特异性扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2-2），结果显示，只有EHP阳性样品泳道有与目的产物分子量大小一致的产物条带，其余泳道均为阴性，进一步说明所设计的引物的特异性。图2-1 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR引物ENF185和ENR185的扩增曲线Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei图2-2 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR扩增产物的电泳M. DL2000；1. EHP的PCR检测为阳性的凡纳滨对虾样品总DNA；2. WSSV纯病毒基因组EHPOtherpathogens
8.3 × 101copies/μL之间均有较强的荧光信号（图2-3），而且扩增曲线呈现标准的S曲线，在模板浓度为8.3 ×100copies/μL时经40个循环扩增，未检测到扩增的荧光信号，说明本实验建立的实时荧光定量PCR至少可以检测到8.3 ×101copies的模板，具有较高的灵敏度。常规PCR采用8.3 ×1058.3 ×101copies/μL质粒标准为模板，经35循环扩增后产物凝胶电泳分析，结果显示该对引物通过常规PCR能检测到的最低为8.3 ×102copies/μL的模板，但是在该浓度下电泳条带亮度特别弱，几乎看不到（图2-4）。说明实时荧光定量PCR至少比常规PCR定性检测的灵敏度高1个数量级。图2-3 虾肝肠胞虫SSU rDNA的质粒标准模板的实时荧光定量PCR扩增曲线Fig.2- 3 Amplification curve of qPCR for E. hepatopenaei SSU rDNA with plasmid strandardtemplates8.3×1088.3×1078.3×1068.3×1058.3×1048.3×1038.3×1028.3×1018.3×100
本文编号：2781075
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945.4
【图文】：
除了EHP的常规PCR为阳性的样品有扩增曲线外，其余样品以及阴性对照均没有检测到荧光信号。将实时荧光定量PCR特异性扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2-2），结果显示，只有EHP阳性样品泳道有与目的产物分子量大小一致的产物条带，其余泳道均为阴性，进一步说明所设计的引物的特异性。图2-1 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR引物ENF185和ENR185的扩增曲线Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei图2-2 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR扩增产物的电泳M. DL2000；1. EHP的PCR检测为阳性的凡纳滨对虾样品总DNA；2. WSSV纯病毒基因组EHPOtherpathogens
对虾总DNA、HPV阳性的中国明对虾总DNA、纯化WSSV的核酸、感染副溶血弧菌的凡纳滨对虾总DNA、健康凡纳滨对虾总DNA以及水为模板的空白对照，用引物ENF185和ENR185进行实时荧光定量PCR扩增，其扩增曲线（图2-1）显示，除了EHP的常规PCR为阳性的样品有扩增曲线外，其余样品以及阴性对照均没有检测到荧光信号。将实时荧光定量PCR特异性扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2-2），结果显示，只有EHP阳性样品泳道有与目的产物分子量大小一致的产物条带，其余泳道均为阴性，进一步说明所设计的引物的特异性。图2-1 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR引物ENF185和ENR185的扩增曲线Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei图2-2 虾肝肠胞虫SSU rDNA 实时荧光定量PCR扩增产物的电泳M. DL2000；1. EHP的PCR检测为阳性的凡纳滨对虾样品总DNA；2. WSSV纯病毒基因组EHPOtherpathogens
8.3 × 101copies/μL之间均有较强的荧光信号（图2-3），而且扩增曲线呈现标准的S曲线，在模板浓度为8.3 ×100copies/μL时经40个循环扩增，未检测到扩增的荧光信号，说明本实验建立的实时荧光定量PCR至少可以检测到8.3 ×101copies的模板，具有较高的灵敏度。常规PCR采用8.3 ×1058.3 ×101copies/μL质粒标准为模板，经35循环扩增后产物凝胶电泳分析，结果显示该对引物通过常规PCR能检测到的最低为8.3 ×102copies/μL的模板，但是在该浓度下电泳条带亮度特别弱，几乎看不到（图2-4）。说明实时荧光定量PCR至少比常规PCR定性检测的灵敏度高1个数量级。图2-3 虾肝肠胞虫SSU rDNA的质粒标准模板的实时荧光定量PCR扩增曲线Fig.2- 3 Amplification curve of qPCR for E. hepatopenaei SSU rDNA with plasmid strandardtemplates8.3×1088.3×1078.3×1068.3×1058.3×1048.3×1038.3×1028.3×1018.3×100
【参考文献】
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1 刘吉平;卢铿明;徐兴耀;严海峰;宁波;;单抗免疫金银染色法诊断家蚕微孢子虫的研究[J];广东蚕业;1995年03期
2 牛安欧,刘红云,周敏,朱峰,方正明;检测微孢子虫韦伯氏Chromotrop染色法[J];中国人兽共患病杂志;2000年04期
3 游信毅;叶坤婷;应碧华;苏欣;梁勤;黄少康;;东方蜜蜂微孢子虫孢子冷冻保存后对意蜂工蜂的侵染性[J];中国蜂业;2014年Z2期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王元;脊尾白虾与三疣梭子蟹微孢子虫病的病原和病理[D];上海海洋大学;2013年
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