中华绒螯蟹造血组织及造血作用机理的研究

发布时间：2020-08-06 14:02

【摘要】：造血作用是一系列的复杂过程,包括不同类型的血细胞从特定的造血位点发生、发育以及成熟。造血作用中生成的形态各异的血细胞(免疫细胞),构成了机体细胞免疫和体液免疫的核心和基础,因此了解造血作用中血细胞的发生、分化及其相应的免疫功能,是探究机体免疫防御机制的前提和关键切入点。由于无脊椎动物缺乏适应性免疫系统,它们主要依赖固有免疫系统抵御病原入侵,而其中由细胞免疫发挥了至关重要的作用,细胞免疫所需要的血淋巴细胞主要通过造血作用快速补充。中华绒螯蟹是一种主要养殖于亚洲南部的重要经济甲壳动物,成体内存在独立的造血组织。本研究以中华绒螯蟹为研究对象,鉴定了其成体造血组织的特征,利用流式细胞仪分选了不同血淋巴细胞亚群,通过转录组学分析,探究了造血过程,阐述了活性氧(reactive oxygen species,ROS)和甲壳动物细胞因子Es Astakine对造血过程的调控机制。中华绒螯蟹的造血组织位于其胃的背侧,为一层一系列的卵圆形囊泡构成的薄膜。其中的囊泡内含有大量细胞核相对较大的圆形细胞。这些细胞由结缔组织包裹,含有大量线粒体,并且多数造血组织细胞处于有丝分裂前期和中期。EdU标记实验也证明了造血组织细胞呈现出相当旺盛的DNA复制活动。造血相关转录因子Runx1特异性表达在中华绒螯蟹造血组织中,可能存在3个不同的蛋白异构体。GATA1在造血组织和血淋巴细胞中均有表达,但可能以不同的蛋白异构体形式存在,参与新生血淋巴细胞的成熟与释放。通过流式细胞仪分选,中华绒螯蟹的血淋巴细胞被分为P1和P2。P1型血淋巴细胞形状较小,内含大量着色较深的嗜酸性颗粒,因此可能主要为粒细胞。P2型血淋巴细胞大小不一且颗粒度较小,可能主要由透明细胞和半粒细胞组成。正常条件下,P1和P2型血淋巴细胞都具有吞噬能力,并且吞噬率相似。但是LPS刺激之后,P1型血淋巴细胞的吞噬率显著性上升,而P2型血淋巴细胞未出现显著性变化,表明P1型血淋巴细胞是中华绒螯蟹中行使吞噬功能的主要细胞类群。此外,P1型血淋巴细胞中的ROS、溶酶体及钙离子水平也显著高于P2型血淋巴细胞。RT-PCR结果表明,病原识别、吞噬、杀菌、溶酶体以及抗氧化作用相关的基因在P1血淋巴细胞中特异性高表达;而酚氧化物酶原激活系统相关的基因在P2血淋巴细胞中显著性高表达。P1血淋巴细胞为免疫应答中行使吞噬功能的主要细胞类群,但仍有超过80%的P1血淋巴细胞不具有吞噬能力,同时造血组织细胞也具有一定的吞噬能力,结果也揭示了中华绒螯蟹血淋巴细胞并没有完全特化,可能由多种细胞共同发挥类似作用。本研究也构建了造血组织和血淋巴细胞的六个转录文库,共得到51,229,690条单边变长的序列,拼接后共得到31,346个基因作为参考基因组。经过组装之后,共筛选出362个差异表达基因。造血组织中高表达的301个基因富集在与DNA、RNA和蛋白质合成、细胞分裂以及能量代谢相关功能群。其中与线粒体ROS产生相关的基因mitochondrial complexes I在造血组织中的表达水平是血淋巴细胞中的8.6倍。这些上调基因表明了造血组织中具有旺盛的细胞分裂活动以及氧化还原反应。在61个血淋巴细胞上调的基因中,参与酚氧化酶原(prophenoloxidase,pro PO)激活的蛋白酶以及proPO大量富集,表明proPO可能作为成熟血淋巴细胞的标记分子。和血淋巴细胞相比,造血组织中的ROS水平相对较高。当造血组织中的ROS被其清除剂NAC清除之后,可以延迟由嗜水气单胞菌刺激引起的血淋巴细胞增多。推测ROS可促进造血组织中细胞的增殖和分化,是中华绒螯蟹造血的重要调节因子。Astakine是甲壳动物中发现的参与造血的细胞因子。本研究从中华绒螯蟹的EST库中鉴定并克隆得到了一个全长为1163 bp的EsAstakine基因,其编码一个128个氨基酸的短肽。EsAstakine二级结构包括一个信号肽结构域和一个前动力蛋白结构域,其中有9个保守的半胱氨酸残基。EsAstakine与淡水龙虾和斑节对虾中的Astakine在序列和进化上更为接近。EsAstakine的mRNA主要在血淋巴细胞和肝胰腺组织中表达,并且鳗弧菌和毕赤酵母的刺激可以显著提高血淋巴细胞中EsAstakine的表达量。在嗜水气单胞菌的刺激下,EsAstakine的表达水平和血淋巴细胞的总数变化趋势一致。注射EsAstakine重组蛋白可以显著提高血淋巴细胞的总数和造血组织细胞的ROS水平,也可以引起JNK和mTOR信号通路相关基因的表达水平上升。EsAstakine的RNA干扰可以显著延迟由嗜水气单胞菌刺激引起的血淋巴细胞增多并且减少造血组织细胞的DNA复制活动。同时,线粒体上的ROS重要产生基因mitochondrial complexes I的干扰,不仅降低造血组织细胞的ROS水平,同时显著抑制由EsAstakine的重组蛋白注射引起的血淋巴细胞数目的增多。上述结果表明在病原刺激条件下,血淋巴细胞产生大量EsAstakine,EsAstakine随循环系统作用于造血组织细胞,引起胞内ROS水平上升,可能通过激活JNK通路,促进造血细胞的分化以及血淋巴细胞的再生。综上所述,中华绒螯蟹存在特化的造血组织和功能上有一定分化的血淋巴细胞亚群。ROS能够促进造血组织细胞的增殖和分化。EsAstakine通过ROS依赖的信号通路促进造血细胞的增殖及血淋巴细胞的再生。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

干细胞,后代

中华绒螯蟹造血组织及造血作用机理的研究造血干细胞依靠它所在微环境（niche）来调节其自我更新以及分化能力[3]。Niche（图 1-2）是指在组织解剖学上干细胞所处的特定位置，它可以通过与干细胞之间的相互作用来调节干细胞的命运。在胚胎发育的过程中，niche 中的许多因子作用于胚胎干细胞，从而诱导它们增殖和分化来促进胚胎的发育。在成体中，干细胞的 niches维持成熟干细胞长期处于静息状态，但是在组织受到损伤之后，周围的微环境活跃地将信号传递到干细胞中来促进它们的更新和分化从而形成新的组织[4]。Niche 中干细胞发挥其特定功能是由以下一些重要因素调节的：干细胞与干细胞之间的相互作用，干细胞与相邻的已经分化的细胞之间的相互作用，干细胞与细胞粘附分子、细胞外基质、氧张力、生长因子、细胞因子、环境的物理性质如 PH、离子以及一些代谢物（如 ATP）之间的相互反应。干细胞和其 niche 之间是相互依赖、互惠共存的[5]。

造血干细胞,转化生长因子-β,交感神经元,血管生成素

第一章绪论持，包括血管外周基质细胞（perivascular stromal cells）、内皮细胞（endothelial cells）、巨噬细胞（macrophages）、交感神经元（sympathetic neurons）和非髓鞘化的施万细胞（nonmyelinating Schwann cell）。CXCL2 和 SCF 是已知的维持造血干细胞功能的重要因子，以及其它一些调节因子包括多效生长因子（pleiotrophin）、血管生成素1（angiopoietin 1）和转化生长因子-β（TGF-β）。Notch 和 Wnt 信号通路也在其中发挥了关键的作用（图 1-3）。然而骨细胞（osteoblasts）对于维持造血干细胞来说并不是必不可少的但是它们对于淋巴前体细胞具有重要的调节作用[8, 9]。

造血系统,果蝇

用主要分为两个阶段[14]（图 1-4）。第一个阶段发生在早期胚胎的头部中胚层，主要是由造血前体细胞（prohemocytes）分化形成晶细胞（crystal cells）和浆细胞（plasmatocytes）[15]。浆细胞具有和高等哺乳类动物巨噬细胞类似的功能，它们可以吞噬入侵的病原体或者自身凋亡的细胞[16]。晶细胞是原始的血小板，它们在创伤修复以及病原杀伤过程中起到关键作用[17]。由造血前体细胞分化成为浆细胞或者晶细胞需要特定的转录因子 Gcm（Glide/Glial Cell Missing）或者 L（RUNX transcription factor Lozenge）参与调节[18-20]。胚胎时期产生的血细胞将依然存在于幼体阶段，它们可以在角质层形成细胞簇或者在血淋巴中作为循环血淋巴细胞[21-22]。在幼体阶段，另一阶段的造血作用发生于淋巴结器官，干细胞样的造血前体细胞可以在此产生成熟的血淋巴细胞[23]。胚胎和幼体时期产生的血淋巴细胞都可以存留到成体阶段并且成体中的各个部位中都可以找到它们，它们在成体中发挥这不可或缺的作用[24]。

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