尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）脂肪水解代谢的营养调控研究

发布时间：2020-08-07 14:15

【摘要】：高能量密度(高脂或高糖)饲料、不平衡的营养元素组成以及水体金属含量等众多问题均能够引起养殖鱼类的脂肪过度积累。脂肪的过度积累不仅能降低鱼的生长和饲料效率,同时也能降低鱼的免疫力、抗应激能力并引起能量代谢紊乱。现阶段罗非鱼(Oreochromis niloticus)养殖过程中存在相同的问题。脂肪水解(lipolysis)是细胞中甘油三酯逐步水解产生脂肪酸和甘油供能的过程,在哺乳动物相关研究中,常针对该生理过程设计药物、营养添加剂等以缓解肥胖和超重。但是,现阶段鱼类脂肪水解,尤其是其调控机制以及生产上降低脂肪过度积累,促进脂肪利用的营养调控研究仍然较少。为了研究罗非鱼脂肪水解调控机制并探索其在生产上降低鱼体脂肪过度积累,促进脂肪利用,本实验应用分子生物学、细胞生物学和营养学等技术手段,通过筛选不同的促脂肪水解药物,研究了其调控罗非鱼脂肪水解机制;同时,探讨了2种促脂肪水解添加剂在罗非鱼活体中对缓解脂肪积累、提高蛋白效率的应用效果和机制。本研究结果可以为今后罗非鱼脂肪水解机制以及缓解罗非鱼脂肪过度积累的营养调控研究提供参考。本实验的结果和结论如下:1.罗非鱼甘油三酯脂酶的表达特征甘油三酯脂酶(ATGL)是脂肪水解第一步的限速酶。哺乳动物中,许多促脂肪水解药物均能通过调控ATGL的活性来达到缓解肥胖,控制体重的目的,而鱼类ATGL,尤其是罗非鱼ATGL的基因结构及表达特征研究较少,为了研究罗非鱼脂肪水解的特征和机制,从而进一步探讨如何缓解罗非鱼脂肪过度积累,促进脂肪利用,本实验首先克隆了罗非鱼ATGL的基因全长,其ORF长度为1539 bp,编码512个氨基酸的多肽,蛋白质理论分子量为56.96 k Da,等电点为5.81,主要定位于于细胞质中;分析其功能域,发现ATGL属于Patatin-like phospholipase domain-containing protein(PNPLA)家族,其Patatin-like phospholipase功能域在1-250氨基酸;对其基因组成进行在线比对,ATGL与大黄鱼的相似度最高,达78%,其次是青龙斑(76%),与半滑舌鳎、大弹涂鱼、鲤鱼及巴沙鱼的相似性均接近70%,与虾虎鱼相似度最低为54%。组织表达分析表明,罗非鱼ATGL在肝脏和脂肪组织中表达量最高,其次是肾脏、大脑、心脏、红肌、脾脏以及头肾组织,表达量最低的为鳃。同时,采用饥饿的处理方式促进罗非鱼脂肪水解以研究ATGL在脂肪水解中的表达特征。结果表明,饥饿第一天,罗非鱼肝脏、肌肉及脂肪组织的ATGL表达量均显著上升,其中,肝脏中ATGL表达量高达对照组的15倍。随着饥饿时间的增加,肌肉中ATGL表达量逐渐下降,到第五天时,下降为最低。肝脏组织中,饥饿第三天则下降至对照水平,随即保持不变。脂肪组织在整个饥饿周期中,均保持较高的表达水平。该结果表明,脂肪组织中的ATGL对饥饿引起的脂肪水解十分敏感,为后续筛选促脂肪水解药物,促进罗非鱼脂肪组织脂肪水解提供了理论基础。2.罗非鱼脂肪和肝脏原代细胞分离方法优化及促脂肪水解药物筛选细胞培养技术具有操作方便,均质性较好并能够直接暴露于药物并进行观察等优点,因此成为生理功能研究的重要技术之一。为了进一步研究罗非鱼脂肪水解的调控机制,本实验采用罗非鱼原代细胞培养技术并筛选出工具药物。本实验首先参考了其他鱼类原代细胞分离方法,结合罗非鱼生理状态,对其分离条件进行了优化,结果显示,罗非鱼的原代细胞分离需要在罗非鱼适应温度28℃条件下进行,且离心条件应该为常温400g;当获取到罗非鱼原代肝脏和脂肪细胞后,选用多种哺乳动物中常用的促脂肪水解药物对罗非鱼原代细胞进行处理,结果显示促甲状腺素和异丙肾上腺素在罗非鱼原代细胞中不能促进脂肪水解,甚至具有抑制作用,而毛喉素能够显著上调罗非鱼肝脏和脂肪原代细胞的脂肪水解,并具有时间效应,因此选用毛喉素作为研究罗非鱼脂肪水解调控的工具药物。在确定工具药物后,为了进一步研究在脂肪水解水平上调的条件下罗非鱼原代细胞脂质成分和含量,选取了薄层层析色谱法(TLC)对罗非鱼原代细胞进行分析。本实验首先对TLC的展层溶剂进行了筛选,结果显示选用庚烷:乙醚:醋酸=55:45:1时,TG、sn1,2/1,3-甘油二酯(Diglyceride,DG)、及油酸(Oil acid,OA)标准品展层效果最为清晰,因此选用该配比作为后续TLC实验的展层溶剂;利用TG标准品及其碘染后的吸光值构建线性方程,线性关系为浓度=0.0023*吸光值-3.2534,R~2=0.9988,说明TLC方法可以定量分析样品TG,为后续实验提供了技术基础;使用TLC分析毛喉素刺激后的罗非鱼肝脏和脂肪细胞,结果显示,其TG含量显著降低,同时DG显著积累,提示DG在罗非鱼调控脂肪水解过程中占有重要作用。3.毛喉素对促进罗非鱼脂肪水解和脂肪利用的影响之前的实验优化了罗非鱼肝脏和脂肪原代细胞分离方法并筛选出毛喉素作为促脂肪水解药物,本实验进一步研究了毛喉素对罗非鱼肝脏和脂肪原代细胞脂肪水解调控。首先利用不同浓度的毛喉素(0,50μM,100μM)对毛喉素的应用浓度进行了筛选,结果显示50μM能上调2种原代细胞游离脂肪酸和甘油释放,并且降低细胞TG含量,因此选择50μM位后续实验的最适浓度。基因表达结果显示,毛喉素能够显著上调甘油三酯脂酶(ATGL)和蛋白激酶A(PKA)的基因表达,同时β氧化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)以及肉碱棕榈酸酰基转移酶1(CPT1),因此说明毛喉素能够上调脂肪水解酶和脂肪酸氧化。本实验进一步研究了毛喉素对降低罗非鱼活体脂肪积累,促进脂肪利用的影响,结果表明,毛喉素虽然不影响构罗非鱼肥胖模型的生长率及全鱼和肌肉粗蛋白,但能显著降低罗非鱼饲料系数,同时下调了罗非鱼的肝体比和脂体比。此外,口服0.5及1.5mg/kg鱼体重的毛喉素能够显著降低全鱼和肝脏粗脂肪,并能减少肝脏和脂肪组织中的脂肪空泡,说明口服毛喉素能够降低罗非鱼活体脂肪积累,促进脂肪利用。基因结果显示,口服毛喉素的罗非鱼其ATGL,敏感激素脂酶(HSL)、甘油一酯脂酶(MGL)以及PKA基因表达显著上调,同时,β氧化相关基因,PPARα,脂肪酸结合蛋白1(FABP1)、CPT1以及乙酰辅酶A氧化酶(ACO)也有显著上调,说明口服毛喉素通过上调脂肪水解和β氧化促进脂肪利用,提示毛喉素在缓解罗非鱼脂肪过度积累上的应用前景。4.甘油二酯对促进罗非鱼脂肪水解和脂肪利用的影响对脂肪水解水平上调的肝脏和脂肪细胞脂质成分分析的结果说明,毛喉素促进的脂肪水解能够引起甘油二酯(DG)的积累,说明DG可能在脂肪水解中具有重要作用。哺乳动物的相关研究证明DG能够促进脂肪水解,考虑到DG作为食品添加剂的安全性,DG可能更适合实际养殖,因此本实验研究了DG对罗非鱼脂肪水解的调控和活体脂肪利用的影响:首先,利用DG类似物1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol(DSG),在肝脏和脂肪原代细胞上筛选了DSG促进脂肪水解的最佳浓度和时间,其次检测了DSG对脂肪水解和脂肪酸氧化相关基因表达的影响。结果表明,DG能够显著增加罗非鱼肝脏和脂肪细胞脂肪水解并上调了其脂肪水解酶及脂肪酸代谢相关基因。利用不同浓度的DG作为脂肪源饲喂罗非鱼,结果显示DG能促进罗非鱼的生长并降低其饲料系数,罗非鱼肝体比和脂体比。此外DG饲喂能够降低全鱼和各组织的粗脂肪和TG含量,肝脏脂滴空泡数量也有显著减少,说明DG能够降低罗非鱼脂肪积累。基因结果显示,DG能够显著上调肝脏和肌肉组织的脂肪水解酶(ATGL、HSL、MGL),脂肪酸代谢(脂肪酸合成酶FAS、脂蛋白脂酶LPL、胆固醇调节元件结合蛋白SREBP、ACO、CPT1、PPARα)基因表达,同时也能够上调其蛋白代谢相关基因,说明DG能够通过促进脂肪水解,FA氧化和蛋白代谢来降低脂肪积累,促进体蛋白合成。但是,高浓度的DGO展现出了对罗非鱼生长的负面效果,表现为存活率的下降和应激相关基因的上调,因此DG在罗非鱼的应用还需要进一步的研究。综上所述,本论文结果说明罗非鱼ATGL调节了脂肪组织中的脂肪水解,并能够被FSK和DGO上调,同时FSK和DG还能显著缓解罗非鱼活体的脂肪积累,促进蛋白合成,这为研究鱼类脂肪分解的调控机制以及在生产上降低鱼类脂肪过度积累、促进脂肪利用、节约蛋白以及保障鱼体健康具有重要参考意义。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

甘油三酯,甘油,甘油二酯,脂滴

华东师范大学博士学位论文ATGL）并确定其为甘油三酯水解第一步的关键酶[11,12]。脂滴甘油三酯水解的过程被简要的分为三个步骤：ATGL和HSL将甘油三酯水解为脂肪酸和甘油二酯，HSL 将甘油二酯水解为甘油一酯，MGL 则完成最后一步将甘油一酯水解为脂肪酸和甘油(图 1-1)。由于脂滴甘油三酯水解及其调控参与了多种生理过程，因此，以 ATGL、HSL 和 MGL 及其调控机制成为脂代谢研究热点之一。

结构图,结构图,区间,脊椎动物

PNPLA1-9[14]。ATGL 的正式命名为 PNPLA2，该脂酶进化较为保守，广泛分布于真核生物体内，包括脊椎动物，非脊椎动物，植物及真菌等[15 17]。根据 ATGL序列的保守性和功能域，可以将其划分为 4 个序列区间：区间 A 是由 N 端 250个氨基酸构成的 α/β/α 水解折叠结构（AA1-AA250），包含了一个典型的 180 个氨基酸的 patatin 结构域，Rydel 及 Villena 的研究认为该区域丝氨酸 47 至天冬氨酸 166（Ser47-D166）可能是是 ATGL 的催化活性中心[17,18]，2010 年，Duncan 等的研究确认了这两个位点是甘油三酯水解的核心区域[19]。区间 C 为 89 个氨基酸组成（AA309-A391）,含有较多的疏水残基，Kobayashi 的研究认为区间 C 可能与 ATGL 在脂滴上的定位和相互作用有关[20]。区间 B、D 分别为 AA250-309 以及 AA391-486，目前其功能尚不清楚，需要进一步研究。

结构图,结构图,氨基酸,折叠结构

华东师范大学博士学位论文用（Fatty acid binding protein 4）[34 37]；C 端结构域（氨基酸 301-768）包含一个在许多脂酶中常见的折叠结构，α/β 水解折叠[38,39]；第三个结构域属于 HSL 的调节模块，这个区域（氨基酸 521-669）位于 HSL 的催化区域并包含所有 5 个已知的磷酸化位点[39,40]（图 1-3）。

【相似文献】