防治对虾急性肝胰腺坏死症（AHPNS）消毒剂的筛选研究

发布时间：2020-08-15 08:40

【摘要】：对虾急性肝胰腺坏死症(Acute hepatopancreas necrosis syndrome,AHPNS),与早死综合症(early mortality syndrome,EMS),是近年来对东南亚和拉丁美洲的对虾养殖业造成重大损失的疾病,其主要病原都是副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。副溶血弧菌为弧菌科(Vibrio Pacini 1854)弧菌属(Vibrionaceae Veron 1965)细菌的成员。该菌是一种危害较大的病原菌,既可以导致多种水产动物发病又可以引起人的副溶血弧菌肠炎。本研究主要目的是从已有的消毒剂种类中寻找能高效杀灭副溶血弧菌的消毒剂,并对这种消毒剂的一些化学性质,杀菌机理来进行初步探究。(1)不同消毒剂对副溶血弧菌的杀灭能力比较及最佳消毒剂筛选选取生产实践中常用的卤素类、季铵盐类、聚合胍类和醛类共计22种消毒剂于实验室条件下,用悬液定量杀菌法,培养24h,在0.5mg/L浓度进行不同种类消毒剂杀灭副溶血弧菌效果比较,用杀灭对数值表示杀灭能力的大小。试验结果表明,卤素类杀菌能力最强的是碘溴海因,0.5mg/L的杀灭对数值为5.6;季铵盐类杀菌能力最强的是双链季铵盐络合碘,杀灭对数值为5.52;聚合胍类效果最好的是聚六亚甲基胍盐酸盐(PHMGH),杀灭对数值为6。醛类、溴硝醇、过硫酸氢钾复合盐消毒效果较差,杀灭对数值仅为1。由此可见不同种类的消毒剂对副溶血弧菌的杀灭能力存在明显差异,以聚合胍类的杀菌性能最好,醛类的杀菌性能最差。(2)消毒剂的毒性安全性实验选取上述试验中筛选获得的PHMGH作为研究对象。探究该消毒剂的急性毒性和安全浓度,以达到科学用药目的。试验结果得到PHMGH的24小时半数致死浓度87.49mg/L,48小时半数致死浓度27mg/L,该消毒剂的安全浓度2.7mg/L。(3)副溶血弧菌人工感染对虾后治疗试验对健康对虾进行人工感染副溶血弧菌,得到能有效感染对虾的副溶血弧菌菌悬液浓度为10~7cfu/mL,再在该菌悬液浓度下设置不同的PHMGH浓度,观察不同浓度的PHMGH对人工感染副溶血弧菌的对虾的死亡率降低效果。实验结果表明PHMGH在浓度为0.2mg/L-0.5mg/L时对降低副溶血弧菌感染的死亡率是有明显效果的。(4)消毒剂的杀菌机理探究杀菌原理可能是由于PHMGH溶于水后的产物带正电荷,细菌表面带负电荷,二者结合后会堵住细菌呼吸通道,导致细胞死亡。实验一,对不同种类细菌悬液进行定量杀菌实验,分为革兰氏阳性和阴性,观察消毒剂对两类细菌杀灭能力的差异性。实验二,用SYTOX Green荧光染料对用PHMGH处理过的副溶血弧菌染色,该染料和死亡细胞的细胞核结合,在紫外光激发下可以产生绿色荧光。结果显示PHMGH会使细胞膜破损。(5)消毒剂在生产实践中应用对正处于副溶血弧菌爆发时的对虾养殖池塘,进行PHMGH消毒处理。向池塘中投加PHMGH,使其终浓度达到0.2mg/L。持续5天检测施用后对虾体内和水体副溶血弧菌含量。结果显示0h-24h内对虾体内的副溶血弧菌含量略有上升,24h之后对虾体内的弧菌含量开始大幅度下降。水体中副溶血弧菌一直处于下降趋势。PHMGH是一种能高效杀灭副溶血弧菌的消毒剂,对养殖对虾具有较高的安全浓度,对被人工感染副溶血弧菌的对虾能起到有效的保护作用,可以有效杀灭多种水产养殖中致病菌。对副溶血弧菌的主要杀灭过程是破坏细菌细胞膜的完整性。本研究为PHMGH在水产养殖中的大量推广应用提供了理论基础。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S945.4
【图文】：

副溶血弧菌,亚甲基,对虾,安全浓度

PHMGH 对对虾的急性毒性和安全浓度当 PHMGH 的浓度为 0.2mg/L 到 1.442mg/L 之间，48h 内无对虾死亡现象GH 浓度达到 10.209mg/L 时，24h 即出现死亡，未死的对虾 48h 死亡数目增达到 72.193mg/L 时，死亡趋势和 10.209mg/L 相同。当浓度为 500mg/L 时之内即全部死亡。消毒剂刚加入时，除最后两组出现对虾跳跃不安等应激剩余组的对虾无异常反应，但是 24h后，出现死亡的组中，部分未死虾则伏，身体僵硬，丧失行动能力。通过计算得到 24h 半数致死浓=87.49mg/L，48 小时半数致死浓度为 LC50=27mg/L，安全浓度 SC 为 2.7m见表 3.2和图 3.2.1。图 3.1.1 聚六亚甲基胍盐酸盐最小杀灭副溶血弧菌浓度的确定Fig. 3.1.1 M inimum bactericidal concentration of PHM GH to V.P

对对,死亡率,副溶血弧菌,对虾

图 3.2.1 不同浓度的 PHMGH 对对虾死亡率的影响Fig. 3.2.1 mortality rate of shrimp treated by different concentration of PHM GH PHMGH 对人工感染副溶血弧菌对虾的保护作用.1 副溶血弧菌对对虾有效感染浓度的确定试验结果如图 3.3.1 显示，当副溶血弧菌菌悬液浓度在 1×106cfu/mL 时，对虾累亡率仅有 10%。当菌悬液 1×107cfu/mL 时，48h 内可以使对虾死亡率达到 80%以其他几组菌悬液浓度不会对对虾造死亡。可以看出菌悬液对对虾的有效侵染浓度值在浓度 1×106cfu/mL-1×107cfu/mL 之间，因此选择 1×107cfu/mL 作为后面MGH 保护试验中的侵染浓度。

副溶血弧菌,人工感染,死亡率,对对

图 3.3.1 副溶血弧菌对对虾人工感染导致死亡率Fig. 3.3.1 mortality rate of shrimp treated by different concentration of V.P bacteria suspension.2 PHMGH 对人工感染副溶血弧菌对虾的保护作用实验结果如图 3.3.2 显示，PHMGH 的浓度在 0.2mg/L 时，即可以对被副溶血弧的凡纳滨对虾有明显的治疗效果，当浓度达到 0.5mg/L 时，对虾成活率达。但是当 PHMGH 的浓度大于 0.5mg/L 时，病虾成活率不再有明显差异。因此养殖实际生产中，可以根据对虾发病的情况，使用浓度 0.2mg/L-0.5mg/L，可有效的防治对虾肝胰腺坏死症。

【参考文献】