嗜水气单胞菌碳纳米管载亚单位疫苗的研制及免疫效果评价

发布时间：2020-08-15 15:21

【摘要】：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种革兰氏阴性短杆菌,该菌广泛分布于淡水和海水中,能够感染鱼类、两栖类、爬行类及人类,是一种重要的“人—兽—鱼”共患的条件性致病病原菌。由该菌引发的细菌性败血症,已成为制约我国水产养殖业发展的重要疾病。疫苗免疫是预防该病最为有效的措施。对于水产动物疫苗的免疫途径,注射方式效果最好,但不适用于渔业生产;浸浴免疫操作简便,而皮肤保护屏障等限制了其推广应用。因此,寻求一种可用于规模化免疫的非注射免疫方式,使其达到注射免疫效果,成为渔用疫苗商业化的关键。碳纳米管(Carbon nanotubes)作为一种纳米载体具有较多的可修饰位点,并且极易穿透细胞和组织屏障,在生物分子转运方面具有良好的应用前景。本研究以嗜水气单胞菌气溶素蛋白(aerA)作为疫苗设计靶点,通过原核重组和化学合成技术构建碳纳米管载亚单位疫苗系统。并以幼龄草鱼为实验对象,通过浸浴和注射方式对其进行免疫,结合攻毒试验评价疫苗免疫保护效果。具体研究内容及结果如下:1.以嗜水气单胞菌气溶素基因为模板,通过原核重组技术构建含原核表达质粒pET32a-aerA的菌株。经IPTG诱导表达获得包涵体形式的重组蛋白(71.4 kDa),结合纯化和复性处理,制备重组aerA亚单位疫苗。随后经缩合酰化法将重组aerA亚单位疫苗与功能化修饰的单壁碳纳米管进行连接,制备碳纳米管载aerA蛋白疫苗系统(SWCNTs-aerA),BCA法测得该疫苗系统中aerA蛋白百分含量为41.6%。2.采用SWCNTs-aerA疫苗对幼龄草鱼(1.0 g)分别进行浸浴和注射免疫,结合攻毒试验评价疫苗免疫保护效果。结果显示:在相同免疫浓度或剂量条件下,SWCNTs-aerA疫苗免疫与aer A疫苗免疫相比,抗体效价水平显著提高(P0.05)。aerA疫苗浸浴和注射免疫最高浓度(50 mg/L)或剂量组(20μg/尾)的免疫保护率分别为47.4%和48.1%,而SWCNTs-aerA疫苗浸浴和注射免疫最高浓度或剂量组的免疫保护率分别为84.9%和79.6%。因此,SWCNTs能够提高亚单位疫苗免疫保护率,通过浸浴免疫达到注射免疫保护效果。3.采用高通量测序技术对不同处理条件下草鱼(对照组、疫苗免疫组和嗜水气单胞菌感染组)肠道内的微生物进行检测,分析疫苗免疫对肠道微生物菌群的影响。结果显示:对照组中气单胞菌比例为10.43%,嗜水气单胞菌攻毒后菌数明显上升至19.48%;aerA疫苗免疫组气单胞菌比例为6.21%,攻毒后菌数上升至6.92%;SWCNTs-aerA疫苗免疫组气单胞菌比例为5.91%,攻毒后菌数为4.85%。aerA疫苗和SWCNTs-aerA疫苗能够维持机体肠道内气单胞菌群组成比例的稳定,有效抵抗嗜水气单胞菌的侵染。综上所述,单壁碳纳米管载亚单位疫苗通过浸浴免疫的方式可以诱导幼龄草鱼对嗜水气单胞菌产生保护性免疫,为渔用疫苗的产业化应用奠定理论基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S948
【图文】：

PCR扩增,嗜水气单胞菌,后提取,预期结果

图 2-1 aerA 基因的 PCR 扩增结NA 标准 DL2000；1. aerA 的 PCR1 The PCR amplification product o Marker DL2000; 1. PCR amplific切胶纯化回收后与pMD19-T菌培养后提取质粒，将 PC录的嗜水气单胞菌 aerA 基。原核表达载体酶切和测序鉴2a-aerA 进行 BamH I 和 Hin5000 bp和1500 bp处各有一带（1482 bp），符合预期结果 2-2 显示。

质粒,嗜水气单胞菌,后提取,预期结果

图 2-1 aerA 基因的 PCR 扩增结 DNA 标准 DL2000；1. aerA 的 PCR.2-1 The PCR amplification product oNA Marker DL2000; 1. PCR amplific切胶纯化回收后与pMD19-T摇菌培养后提取质粒，将 PC收录的嗜水气单胞菌 aerA 基符。因原核表达载体酶切和测序鉴T32a-aerA 进行 BamH I 和 Hin于5000 bp和1500 bp处各有一条带（1482 bp），符合预期结果图 2-2 显示。

重组蛋白,诱导表达,亚单位疫苗,嗜水气单胞菌

嗜水气单胞菌碳纳米管载亚单位疫苗的研制及免疫效胞菌 aerA 蛋白的原核表达白的 SDS-PAGE 分析确的 pET32a-aerA 重组质粒转化入大肠杆菌 BL2达，置于冰上超声破碎裂解菌体，离心后收集析。结果如图 2-3 所示，与未诱导的含 pET32a-aerA32a 空载体菌诱导前后的阴性对照相比，BL21（D量约为 70 kDa 的表达产物，上清部分基本无表达rA 蛋白主要以包涵体的形式存在。

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