溶藻弧菌中Ⅵ型分泌系统对细菌的毒力调控机制

发布时间：2020-08-22 08:38

【摘要】：溶藻弧菌是一种分布广泛的海洋病原菌,生长速度快的特点使其在环境中能够占据优势生态位。溶藻弧菌能够感染包括鱼类、甲壳类、珊瑚虫在内的多种海洋动物,对全球的水产养殖业造成严重损失。包括溶藻弧菌在内的细菌通常使用一些独特的分泌系统适应其所在的环境。Ⅵ型分泌系统(T6SS)正是这样一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的毒力分泌系统。这种多组分的分泌系统介导针对宿主的毒力,也介导细菌之间的竞争。溶藻弧菌EPGS编码了两套T6SS(T6SS1和T6SS2),这两套T6SS均含有完整的13个T6SS核心组件。目前对这两套T6SS的功能知之甚少。我们探索了溶藻弧菌EPGS在平板状态下发挥最优杀菌能力的条件,发现溶藻弧菌的毒力不局限于大肠杆菌,对其他多种海洋细菌都有显著的杀伤作用。共聚焦显微镜和杀菌实验表明,在平板状态下,溶藻弧菌EPGS进行细菌竞争主要依赖于T6SS2,而非T6SS1。qRT-PCR和Western blot数据发现,T6SS2所介导的杀菌活力受到群体感应系统(QS)和磷酸激酶PpkA2的调控。我们采用磷酸化蛋白质谱的筛选方法,鉴定与T6SS2活力相关并依赖于PpkA2的磷酸化底物。与其他细菌一样,PpkA2的自磷酸化对T6SS2的功能至关重要。另一个鉴定到的T6SS2基因簇内蛋白是DotU2,它的两个苏氨酸位点都可以被PpkA2磷酸化,这两个磷酸化位点对p-DotU2是冗余的。p-DotU2能与Fha2结合,激活T6SS2的分泌。处于T6SS2基因簇外的小蛋白VtsR也能被PpkA2磷酸化。这个蛋白通过调控QS中枢元件LuxR的表达,对T6SS2的表达产生重要的影响。在溶藻弧菌EPGS中,PpkA2通过控制一系列的磷酸化蛋白底物介导了 T6SS和QS之间的正反馈通路,提高溶藻弧菌的竞争能力。除了激酶PpkA2,溶藻弧菌EPGS的T6SS2基因簇内,还编码一个隶属于PP2C磷酸酶家族的蛋白PppA。在之前的研究中,PP2C家族磷酸酶主要响应压力应激。PppA-PpkA也能调控其他一些非T6SS的表型。目前,在溶藻弧菌T6SS中PppA扮演的角色还不明确。通过磷酸化质谱的筛选,我们发现PppA的第253位苏氨酸能被PpkA2磷酸化,同时PppA的磷酸酶活性会受到PpkA2调控。在平板状态下,p-PppA调控T6SS2的表达和活力。实验数据进一步表明,PppA蛋白和其磷酸化位点通过LuxR调控T6SS2的活性。本实验室之前的数据表明,在液体环境中,PppA正调控LuxR的表达,因子RpoE直接结合在LuxR的启动子上。通过qRT-PCR,我们发现PppA在转录水平正调控luxR和rpoE。借助Tn-seq技术,尝试寻找了与调控有关的基因。通过Tn-seq的数据,发现了一些可能与PppA调控luxR和rpoE相关的转录调控因子和QS相关基因。同时也发现了一些可能与PppA无关,仅仅是LuxR或RpoE的调控因子。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.4
【图文】：

示意图,机制,示意图,结构学

周质与ＯｍｐＡ／ＭｏｔＢ类似的肽聚糖结合结构域［４２］。当这个结构不存在时，该结构的功能逡逑主要由与ＴｓｓＬ相互作用的必需膜蛋白ＴａｇＬ代替［４２］。在２０１５年，１１．６ＡＴｓｓＪＬＭ膜复合逡逑物的全电子显微镜结构被解析（图１．２）［４３］。逡逑ｇ逦Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ邋ａ逡逑？逦ｔ逦＊逦４逡逑Ｉ逡逑乫削ｔ焌Ｊｉｕｔｔ．ｉｉｍｎｎｎ逡逑、逦ＡＴＰ邋ＡＯ＾逡逑Ｅｘｔｅｎｄｅｄ逦Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ逦？逡逑ｓｔａｔｅ逦＂Ｆ＿〃逦＾ａｓｓｅｍｂｌｙ逡逑（Ａ）逦（Ｂ）逦（Ｃ）逡逑图１．１邋Ｔ６ＳＳ结构和机制示意图１８１逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋Ｔ６ＳＳ．邋（Ａ）邋Ｔｈｅ邋ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ａｎｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍａｃｈｉｎｅｉｙ邋ａｒｅ邋ａｓｓｅｍｂｌｅｄ．邋（Ｂ）邋Ｓｈｅａｔｈ邋ｏｆ邋Ｔ６ＳＳ邋ｃｏｎｔｒａｃｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｐｕｔ邋ｔｈｅ邋ｉｎｎｅｒ邋ｔｕｂｅ邋ｔｏｗａｒｄｓ逡逑ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｃｅｌｌ．邋（Ｃ）邋Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ邋ａｒｅ邋ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｒ邋ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，邋ｔｈｅｎ邋ＣｌｐＶ邋ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｅｓ邋ｔｈｅ逡逑ｃｏｎｔｒａｃｔｅｄ邋ｓｈｅａｔｈ．逡逑生物信息学和结构学的研究表明，Ｔ６ＳＳ中心蛋白形成一个与收缩的噬菌体尾相关逡逑组件类似的细胞刺穿结构。Ｔ６ＳＳ的内管是由Ｈｅｐ的六聚体构建而成

结构模型,蛋白

蛋白会导致Ｈｅｐ蛋白不分泌和杀伤能力的缺失，所以只针对同源ＶｇｒＧ的ＰＡＡＲ蛋白逡逑ＴａｇＤ对Ｔ６ＳＳ组装是至关重要的［４９］。逡逑图１．２大肠杆菌Ｔ６ＳＳ的ＴｓｓＪＬＭ复合物结构１４３１逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＴｓｓＪＬＭ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋ｏｆ邋Ｔ６ＳＳ邋ｆｒｏｍ邋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ．逡逑Ｔ６ＳＳ收缩的鞘由ＴｓｓＢ和ＴｓｓＣ两个蛋白组成，这两个蛋白在体外自发地形成以堆逡逑叠的齿轮为表象的管状结构［５Ｑ］。冷冻电子扫描技术表明鞘在胞内组装，垂直于膜，以中逡逑空的收缩形式或是细长的内部致密形式存在。这个内部致密结构可能就是排出的Ｈｅｐ逡逑管［４６’５１］。在２０１５年，两个＜４邋Ａ的高分辨率电子断层扫描结构表明ＴｓｓＢ和ＴｓｓＣ在原子逡逑层面的相互作用，呈现了一个六倍轴对称的完整结构［５２，５３］。这些结构最显著的特征是来逡逑自同一个螺旋的两个ＴｓｓＣ分子相关的Ｐ折叠和来自邻近螺旋ＴｓｓＢ形成的“握手结构域”，逡逑这个结构域产生交错的Ｐ片，Ｐ片可以提供收缩时保持结构完整所需的结构强度（图１．３）。逡逑目前，延长的鞘还未被发现，所以鞘收缩的精确机制还未知。然而，最近收缩前和逡逑收缩后都与（３片有类似结构的Ｒ２农菌素原子结构的解析

溶藻弧菌,杀菌能力,混合比例,培养基

Ｐｒｅｄａｔｏｒ逦＾逦Ｐｒｅｄａｔｏｒ逦＾逡逑图２．２影响杀菌能力因素的筛选逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋Ｔｈｅ邋ｆａｃｔｏｒ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｋｉｌｌｉｎｇ邋ａｂｉｌｉｔｙ邋ａｓｓａｙ邋ｗｅｒｅ邋ｓｃｒｅｅｎｅｄ．邋（Ａ－Ｄ）邋ＣＦＵ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｗｉｔｈ邋ＥＰＧＳ邋ｏｒ邋ＰＢＳ邋（Ｎｏｎｅ）邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ邋ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋（Ａ），邋ｔｉｍｅ邋（Ｂ），逡逑ｍｉｘｉｎｇ邋ｒａｔｉｏ邋（Ｃ）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＮａＣｌ邋（Ｄ）邋ｗａｓ邋ｃｏｕｎｔｅｄ．逡逑出接合膜的范围，影响菌落计数，所以后期实验选择４邋ｈ。考察菌株混合比例，１：１和逡逑１０：１的杀菌能力均小于４：１邋（ＥＰＧＳ：邋ＭＣ４１００）（图２．２Ｃ）。考察培养基，３％盐浓度的培养逡逑基更适合溶藻弧菌杀菌（图２．２Ｄ）。逡逑综合以上结果，后期杀菌选择的实验条件为３０°Ｃ、４邋ｈ孵育、菌株混合比例４：１和逡逑ＬＢＳ固体平板。在这种条件下，溶藻弧菌ＥＰＧＳ对大肠杆菌能造成？１０００倍的杀伤作用逡逑（Ｎｏｎｅ实验组和ＥＰＧＳ实验组４邋ｈ后大肠杆菌菌浓分别为？９．１３ｘｌ0９邋ＣＦＵ／ｍｌ和？４．９７ｘｌ0６逡逑ＣＦＵ／ｍｌ）（图邋２．２）。逡逑虽然已经找到溶藻弧菌ＥＰＧＳ最优的杀菌条件，但自然环境中菌株会面对无机盐种逡逑类多样的情况。为了进一步模拟溶藻弧菌所处的海水竞争环境，尝试使用含有人工海水逡逑（ＡＳ）的２２１６Ｅ培养基代替普通的ＬＢＳ培养基进行杀菌实验。实验结果表明

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