棉粕和菜粕经TOR、AAR信号通路调控团头鲂生长及肠道微生态的研究

发布时间：2020-09-27 19:53

　　随着水产养殖业集约化的飞速发展,水产饲料业的鱼粉供需矛盾日益加剧,以优质、廉价、来源广泛的植物蛋白源替代鱼粉是维持水产饲料业和水产养殖业可持续发展的必然发展方向。鱼类对植物蛋白利用率低,除了植物蛋白本身的限制性因素如蛋白质不平衡、具有多种抗营养因子外,鱼类本身在蛋白质摄入、代谢及蛋白质转录调控中是否也存在偏好等问题仍不清楚。团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一,因此以团头鲂为代表研究其对饲料蛋白源的利用及相关分子机制、肠道微生态结构具有重要的理论和现实意义。本研究旨在分析团头鲂对植物性饲料蛋白源菜粕、棉粕与动物性蛋白源鱼粉利用的差异,分析饲料中不同蛋白源对蛋白代谢调控通路TOR和AAR信号通路的影响,从蛋白质转录水平分析团头鲂对饲料蛋白源利用的差异,从动物体角度出发探求限制鱼类对植物蛋白利用的因素;同时,分析摄食不同蛋白源饲料后,团头鲂肠道微生态结构的变化,探讨肠道微生态对饲料的适应性,为提高水产动物配合饲料中植物蛋白利用提供研究基础和理论指导。本研究内容主要包括以下6个部分:1比较不同蛋白源对团头鲂生长的影响本试验比较以鱼粉(FM)、棉粕(CSM)、菜粕(CM)以及棉粕、菜粕分别添加赖氨酸和蛋氨酸(CSM+AA、CM+AA)为主要蛋白源的饲料对团头鲂生长的影响,研究结果显示:以棉粕和菜粕为主要蛋白源的饲料显著降低团头鲂的增重率(WGR)、特定增长率(SGR)和蛋白质效率(PER),显著升高团头鲂饵料系数(FCR),但是在棉粕和菜粕组饲料中添加赖氨酸和蛋氨酸后,其WGR、SGR和PER升高,FCR降低,且与FM组差异不显著。在团头鲂形体指标方面,植物蛋白源CSM组和CM组肥满度、脏体比和肝体比显著低于FM组。各组间团头鲂全鱼体成分差异不显著。不同蛋白源饲料对团头鲂肠道蛋白酶和脂肪酶活性影响不显著,但是在棉粕和菜粕组饲料中添加氨基酸可以提高其肠道淀粉酶活性。不同蛋白源饲料对血浆中谷草转氨酶(AST)和肝脏中的谷丙转氨酶(ALT)及Y-谷氨酰胺转移酶(γ-GT)活性影响不显著,但CM组血浆ALT活性显著高于FM组,而肝脏组织中CM+AA组AST活性显著高于FM组。饲料蛋白源不显著影响团头鲂白细胞数、血红蛋白含量和血球容积,但是CSM组的红细胞数显著低于FM组。FM组团头鲂血浆总蛋白含量显著高于CSM+AA组,CSM组和CSM+AA组的尿素氮含量显著高于其他三组,FM组的胆固醇含量显著高于其他各组,CM+AA组葡萄糖含量显著低于CSM+AA组,但是各组间甘油三酯含量差异不显著。2不同蛋白源对肠道PepT1、TOR信号通路、AAR信号通路及肠道微生态的影响探讨饲料中不同蛋白源对肠道PepT1、蛋白代谢调控通路TOR信号通路和AAR信号通路的影响,结果显示:FM组肠道PepT1mRNA水平显著低于其他各组。不同蛋白源饲料不影响团头鲂肠道TOR、4E-BP2和S6K1基因表达水平,但是FM组AKT基因表达水平相较其他各组显著降低。肝脏组织中,在棉粕、菜粕中添加氨基酸后,显著上调TOR基因表达水平。与FM组相比,CM组和CSM组的IGF-1基因以及AKT基因mRNA表达水平显著升高,而添加氨基酸后IGF-1基因以及AKT基因mRNA表达显著下调,与FM组差异不显著。TOR信号通路中的下游调控基因中,S6K1基因的mRNA水平各组间差异不显著,但是在棉粕、菜粕中添加氨基酸后,显著下调4E-BP2的基因表达。肠道组织中,FM组的ATF4基因以及ASNS基因mRNA水平显著低于其他各组,同时FM组的ATF3基因表达水平高于其他各组。在肝脏组织中,棉粕、菜粕组添加氨基酸后,显著下调ATF4基因表达水平;CSM和CM组的ATF3和ASNS基因表达水平高于FM组、CSM+AA组和CM+AA组。团头鲂饲料内的不同蛋白源影响肠道微生物多样性指数。肠道微生物相对丰度结果显示团头鲂肠道内的优势菌群依次为梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)。摄食不同的蛋白源饲料,肠道微生物种类及其丰度存在巨大差异;但是CSM+AA组与CSM组、CM+AA组与CM组的OTU种类一致。3棉粕替代鱼粉对团头鲂生长的影响为了评估日粮中棉粕替代鱼粉水平对团头鲂生长影响,以棉粕分别替代0(CMO)、25%(CM25)、50%(CM50)、75%(CM75)和 100%(CM100)的鱼粉蛋白水平,配置了 5组等氮(36%粗蛋白)等能(16 MJ/kg)的日粮,并添加了晶体赖氨酸和蛋氨酸以保持所有试验日粮中赖氨酸和蛋氨酸含量一致。结果显示:棉粕替代鱼粉水平对团头鲂幼鱼存活率无显著影响;CSM75组和CSM100组的WGR和SGR显著低于其他各组。CSM0组和CSM25组的FCR和摄食率显著低于其他各组;而CSM0、CSM25和CSM50组的PER显著高于其他两组。棉粕替代鱼粉水平不影响团头鲂的肥满度以及全鱼体成分,但显著影响团头鲂脏体比、肝体比。棉粕替代鱼粉水平不影响团头鲂消化道蛋白酶活性、脂肪酶活性以及淀粉酶活性;对团头鲂血浆及肝脏中ALT、AST以及γ-GT活性不产生显著影响。各组间团头鲂血液中红细胞数量、血红蛋白含量以及血球容积差异不显著,但影响白细胞数量。棉粕替代鱼粉水平不影响血浆总蛋白含量、胆固醇含量、甘油三酯含量以及葡萄糖含量,但影响血浆内尿素氮含量。4棉粕替代鱼粉对团头鲂肠道PepT1、TOR信号通路、AAR信号通路及肠道微生态的影响随着棉粕替代鱼粉水平升高,团头鲂肠道内小肽转运载体PepT1 mRNA表达量显著下降,CSM75组和CSM100组的PepT1水平显著低于其他三组。CSM75组和CSM100组肠道TOR基因mRNA水平显著低于其他三组;对照组和CSM25组团头鲂肠道AKT基因mRNA水平显著高于其他三组;CSM75组和CSM100组的肠道4E-BP2显著低于CSM50组,而与其他两组差异不显著;CSM50组S6K1基因mRNA水平显著高于其他各组。CSM100组肝脏TOR基因mRNA水平显著低于对照组和CSM75组,与其他两组差异不显著;CSM75组和CSM100组的IGF-1基因的mRNA水平显著高于CSM25组,而与其他两组差异不显著;棉粕替代鱼粉水平对AKT基因及4E-BP2基因的表达水平不产生显著影响;CSM75组的S6K1基因的mRNA水平显著高于CSM25、CSM50和CSM100组,但是与对照组差异不显著。CSM75组和CSM100组的ATF4基因和ATF3表达水平显著高于其他三组;但是,棉粕替代鱼粉水平对ASNS基因的表达水平影响不显著。CSM100组团头鲂肝脏中ATF4基因表达水平显著高于CSM50组以外的其他三组;CSM50组团头鲂肝脏中ATF3基因表达水平显著高于CSM25组和CSM 100组;CSM 100组ASNS基因的mRNA水平显著高于CSM0、CSM25和CSM50组。团头鲂饲料中棉粕替代鱼粉水平引起肠道微生物多样性指数变化。肠道微生物相对丰度结果显示:肠道内优势菌为乳球菌(Lactococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)和鲸杆菌(Cetobacterium),替代水平显著影响肠道微生物丰度;但是棉粕替代鱼粉水平对团头纺肠道微生物种类影响不明显。5莱粕替代鱼粉对团头鲂生长的影响为了评估日粮中菜粕替代鱼粉水平对团头鲂生长的影响,以菜粕分别替代0(CM0)、25%(CM25)、50%(CM50)、75%(CM75)和 100%(CM100)的鱼粉蛋白水平,配置了 5组等氮(36%粗蛋白)等能(16 MJ/kg)的试验日粮,并添加了晶体赖氨酸和蛋氨酸以保持所有试验日粮中赖氨酸和蛋氨酸含量一致。结果显示:日粮中菜粕替代鱼粉水平不影响团头鲂的存活率;但是随着替代水平升高,WGR、SGR和PER显著降低,FCR和摄食量同时升高,CM75组和CM100组的WGR、SGR和PER显著低于其他三组,FCR和摄食量显著高于其他三组,菜粕替代鱼粉水平不影响团头鲂的肥满度、脏体比、肝体比以及全鱼体成分。菜粕替代鱼粉水平不影响团头鲂消化道蛋白酶活性、脂肪酶活性以及淀粉酶活性;对血浆及肝脏中的ALT、AST以及γ-GT活性无显著影响;不影响血液中血红蛋白含量以及血球容积,但是影响白细胞数量和红细胞数量。菜粕替代鱼粉水平显著影响团头鲂血浆总蛋白含量、尿素氮含量、胆固醇含量和甘油三酯含量,但是各组间葡萄糖含量差异不显著。6菜粕替代鱼粉对肠道PepT1、TOR信号通路、AAR信号通路及肠道微生态的影响CM25组和CM50组团头鲂肠道PepT1 mRNA水平显著高于对照组和CM75组。日粮中菜粕替代鱼粉水平显著影响团头鲂肠道和肝脏TOR信号通路,CM100组团头鲂肠道TOR基因mRNA水平显著低于对照组外的其他三组,并且CM25和CM50组的TOR基因表达水平显著高于对照组;菜粕替代鱼粉水平不影响团头鲂肠道中AKT基因表达水平;CM100组肠道4E-BP2 mRNA显著低于对照组、CM25组和CM75组,同时CM50组显著低于CM0组;CM0组和CM75组的肠道S6K1基因表达水平显著高于CM50和CM100组。在肝脏组织中,CM100组TOR基因mRNA水平显著低于对照组;CM100组IGF1基因表达水平显著高于其他各组;CM75和CM100组的AKT基因水平显著高于对照组和CM25组、CM50组;CM100组的4E-BP2显著高于其他各组;而CM25组的S6K1 mRNA水平最高,显著高于CM50组以外的其他各组。日粮中菜粕替代鱼粉水平显著影响团头鲂肠道和肝脏组织AAR信号通路的基因表达。CM100组的肠道ATF4基因表达水平显著高于其他各组;同时,CM75组和CM100组的ATF3基因表达水平显著高于其他三组;但是菜粕替代鱼粉水平对肠道ASNS基因不产生显著影响。在肝脏组织中,CM75组的ATF4基因表达水平显著高于对照组和CM50组,而与CM25组和CM100组差异不显著;同时,CM75组和CM100组的ATF3基因表达水平显著高于其他三组;但是菜粕替代鱼粉水平对肝脏ASNS基因不产生显著影响。菜粕替代鱼粉水平影响团头鲂肠道微生态群落多样性以及肠道微生物相对丰度,但是对肠道微生物种类影响不明显;团头鲂肠道内的优势菌群为鲸杆菌(Cetobacterium)和乳球菌(Lactococcus)。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

转录机制,信号通路,信号

第一章文献综述所需要的翻译起始因子（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇａｎｄ邋Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，邋２００９），翻译开始的第ｍＲＮＡ邋５’端帽子结构上装配形成ｅＩＦ４Ｆ复合体（Ｍａｔｈｅｗｓ邋ｅｔ邋ａＵ邋２００７；邋Ｓｏｎｅｎｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，邋２００９；邋Ｊａｃｋｓｏｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１０；邋Ｔｏｐｉｓｉｒｏｖｉｃ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１）。ｅＩＦ４Ｆ邋复合体是构连接的ｅＩＦ４Ｅ亚基、骨架蛋白ｅＩＦ４Ｇ以及ＲＮＡ解旋酶ｅＩＦ４Ａ组成（Ｇｉｎｇｒａ９９ｂ；邋Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ邋ａｎｄ邋Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，邋２００９；邋Ｊａｃｋｓｏｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１０）。４Ｅ－ＢＰｓ邋是一个小制子，哺乳动物中其家族包括４Ｅ－ＢＰ１，４Ｅ－ＢＰ２和４Ｅ－ＢＰ３，它通过与ｅＩＦ４到ｅＩＦ４Ｅ结构上来阻止ｅＩＦ４Ｆ复合物的形成（Ｐａｕｓｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９４）。活化时，ＴＯ４Ｅ－ＢＰｓ的Ｔｈｒ３７、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ６５和Ｔｈｒ７０位点，使其与ｅＩＦ４Ｅ结构解离，４Ｆ邋复合体可以正常形成（Ｐａｕｓｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９９４；邋Ｇｉｎｇｒａｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９９９ａ，邋２００１邋）以完始过程。逡逑

蛋白源,植物蛋白,团头鲂,水产动物

棉粕和菜粕经ＴＯＲ、ＡＡＲ信号通路调控团头鲂生长及肠道微生态的研究蛋白源的利用及相关分子机制、肠道微生态结构具有重要的理论和现实意义析团头鲂摄食不同蛋白源饲料后，蛋白质转录水平上与蛋白质代谢调控相关水平的变化，探讨动物蛋白源与植物蛋白源在体内利用时产生差异的机制，角度出发探求限制鱼类对植物蛋白利用的因素，为提高水产动物配合饲料中利用提供研宄基础，为水产配合饲料配方过程中以植物蛋白替代鱼粉、提高利用率提供理论指导，对实现水产养殖业的健康快速可持续发展具有重要意主：逡逑

蛋白源,肠道,团头鲂,基因表达水平

３．１对肠小肽转运载体ＰｅｐＴｌ表达的影响逡逑饲料蛋白源显著影响肠道小肽转运载体的ｍＲＮＡ基因表达水平，ＦＭ组肠道逡逑ＰｅｐＴｌ邋ｍＲＮＡ水平显著低于其他各组（Ｐ＜邋０．０５）（图３－１）。逡逑？逦０．５逦－逡逑Ｅ邋０．４５邋－逦ｂ逦ｂ逡逑？｜逦°－４逦＇逦？逦Ｉ逦Ｔ逦ｂ逡逑Ｉ：逦Ｔ逦Ｔ逡逑４逦ｏ．１逦＿逦＿逦＿逦＿逦＿逦＿逡逑Ｊ０．０５逦■邋Ｉ逡逑ＦＭ逦ＣＳＭ逦ＣＭ逦ＣＳＭ＋ＡＡ逦ＣＭ＋ＡＡ逡逑试验日粮逡逑Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｄｉｅｔｓ逡逑图３－１饲喂含不同蛋白源饲料后团头鲂肠道ＰｅｐＴｌ邋ｍＲＮＡ基因表达水平。图中值为平均值士标准逡逑误（ｎ邋＝邋９），不同字母表示经Ｄｕｎｃａｎ多重比较后差异显著（Ｐ＜邋０．０５）。逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ邋１邋（ＰｅｐＴｌ）邋ｇｅｎｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｌｕｎｔ邋ｓｎｏｕｔ邋ｂｒｅａｍ邋ｆｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｅｔｓ邋ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｔｕｆｆ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｍｅａｎｓ邋ｏｆ邋ｎｉｎｅ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；邋ｍｅａｎｓ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｓ逡逑ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｗｉｔｈ邋ｅａｃｈ邋ｏｔｈｅｒ邋｛Ｐ邋＜邋０．０５）．逡逑３．２肠道以及肝脏ＴＯＲ信号通路相关基因表达的影响逡逑团头鲂摄食含不同蛋白源的饲料后，比较肠道ＴＯＲ通路相关基因（ＴＯＲ、ＡＫＴ、逡逑４Ｅ－ＢＰ２和Ｓ６Ｋ１）的ｍＲＮＡ表达水平（图３－２）。结果显示蛋白源饲料不影响肠道ＴＯＲ逡逑基因的表达水平

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