中华绒螯蟹B52和Dock参与Dscam可变剪接和抗菌肽表达的机制研究

发布时间：2020-10-16 23:29

　　 可变剪接普遍存在于真核生物中,是基因表达调控的重要环节,通过外显子的不同组合可产生一系列差异转录本,在极大程度上丰富了生物体的转录组和蛋白质组多样性。同时,异常的可变剪接也将直接导致机体生理功能的紊乱。因此,可变剪接事件对于生物体正常生理功能的实现是至关重要的。唐氏综合征细胞黏附分子(Dscam)是可变剪接的代表性基因,在果蝇(D.melanogaster)中可潜在产生38,016种可变剪接异构体,且该基因的可变剪接现象仅在节肢动物中发生。令人振奋的是,节肢动物Dscam基因的大量异构体被证明具有免疫特异性,并有学者据此推测该基因可能与免疫致敏(immune priming)或免疫训练(trained immunity)现象有关。为明确Dscam对中华绒螯蟹血细胞蛋白表达的调控,本论文基于同位素标记的iTRAQ蛋白质组学技术对Dscam敲降并金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激的原代培养血细胞分泌蛋白进行了定量分析。结果表明诸多细胞生理功能相关蛋白受到了Dscam的影响,特别是抗菌肽等免疫效应因子的表达受到了Dscam的极显著正调控。proPO等免疫因子在Dscam敲降后呈现显著上调的表达,说明宿主可能通过补偿机制弥补抗菌肽表达的下降。此外,剪接体等细胞内蛋白也在细胞培养液中被检测到显著变化,这可能与细菌导致血细胞破裂从而释放内容物有关。这些结果暗示作为跨膜型蛋白,Dscam的细胞外部分在接收细菌的危险讯息后,极可能将信号传递入细胞内,通过细胞内区域激活相关信号转导途径,产生抗菌肽等免疫效应因子,完成免疫防御过程。因此,本论文将聚焦中华绒螯蟹跨膜型Dscam的可变剪接机制及其细胞质尾可变剪接异构体调控抗菌肽表达的信号转导机制。既往研究报道,RNA二级结构和剪接因子可能是介导Dscam可变剪接的关键环节。因此,我们首先基于果蝇的Dscam RNA二级结构特征序列在中华绒螯蟹Dscam基因全长中进行了比对,结果发现分子对接位点(docking site)、选择子序列(selector sequence)和基因座控制区(locus control region)的协同作用是导致Dscam基因pre-mRNA进行剪接的结构基础。进一步的研究在中华绒螯蟹中分离并鉴定了B52基因(EsB52)。Es B52序列包括一个5’端非编码区(UTR),一个876-bp的开放阅读框(ORF)编码291个氨基酸残基,一个3’端非编码区。EsB52编码的氨基酸序列全长包括两个RNA识别基序(RNA recognition motifs,RRM),分别位于N端的5-70,103-171氨基酸残基。C端富含精氨酸和丝氨酸。每个RRM基序都包含两个短序列RNP-1和RNP2。组织表达分析显示,Es B52 mRNA在所有检测组织中均有广泛表达,尤其是在脑和血细胞中表达较高。在血细胞中,Es B52在与病原体相关的分子模式和细菌刺激后显著上调。此外,Es B52 RNAi降低了mRNA中Ig7亚型的数量,而对于Ig2或Ig3没有影响。上述研究表明,分子对接位点、选择子序列、基因座控制区是中华绒螯蟹Dscam可变剪接的结构基础,而B52等剪接因子是激活Dscam可变剪接的重要调控元件之一。Dscam蛋白广泛存在于节肢动物的免疫系统中,并且其与病原体特异性结合和吞噬细菌的能力已经被证实。然而,Dscam识别并结合病原后如何激活免疫相关的信号通路机制尚不清楚。基于我们实验室前期的研究结果,已经确认了中华绒螯蟹中跨膜型Dscam细胞质尾中的可变剪接外显子以及细胞质尾在血细胞中存在的亚型,并且在革兰氏阳性菌刺激下体外沉默跨膜型Es Dscam会导致抗菌肽表达量下调。在本研究中,我们发现EsDscam细胞质尾非可变剪接32号外显子的翻译蛋白编码SH3结合基序,并因此与Dock蛋白的SH3结合基序相互作用。Dock蛋白具有类似EsDscam调控ERK磷酸化、Dorsal核转运、抗菌肽表达等功能。进一步通过RNAi、Co-IP等技术手段发现Dock蛋白通过非直接结合调控ERK磷酸化。同时本研究也证实可变剪接外显子不具备调控ERK磷酸化、Dorsal核转运和抗菌肽表达的能力。上述研究表明,EsDscam细胞质尾区域通过非可变剪接外显子的翻译蛋白结合Dock蛋白,调控ERK磷酸化,促进Toll信号通路关键分子Dorsal从细胞质进入细胞核,进而上调抗菌肽表达,完成抗菌免疫防御过程。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    第一节 无脊椎动物Dscam基因的研究进展
        1.1 引言
        1.2 Dscam基因的发现
        1.3 Dscam基因的高度可变性
    第二节 节肢动物Dscam基因的免疫功能
        2.1 引言
        2.2 Dscam对不同PAMPs和细菌的免疫应答
        2.3 Dscam对寄生虫和病毒的免疫应答
    第三节 研究意义及实验方案
        3.1 研究意义
        3.2 研究方案
第二章 基于iTRAQ技术筛选中华绒螯蟹Dscam基因调控的蛋白表达
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 实验动物
        2.2 EsDscam的体外干扰实验
        2.3 实时荧光定量PCR检测
        2.4 实验动物免疫刺激
        2.5 统计学分析
        2.6 iTRAQ原理
        2.7 iTRAQ实验流程
        2.8 iTRAQ实验数据分析流程
        2.9 质谱原始数据处理分析
        2.10 蛋白质定性和定量分析参数
        2.11 Gene Ontology(GO)功能注释
    第三节 结果
        3.1 Es Dscam的体外沉默分析
        3.2 蛋白质丰度比分布图
        3.3 蛋白质鉴定及注释
        3.4 差异丰度蛋白的鉴定及定量分析
        3.5 蛋白质样品的基因本体(Gene ontology,GO)分析
    第四节 讨论
第三章 B52 调控Dscam可变剪接
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 实验动物
        2.2 序列比对与二级结构预测
        2.3 样品采集及实验动物免疫刺激
        2.4 总RNA提取和第一链c DNA合成
        2.5 全长Es B52 cDNA的克隆
        2.6 全长Es B52 cDNA的生物信息学分析
        2.7 实时荧光定量PCR检测
        2.8 EsB52的体外干扰实验
        2.9 在Es B52 沉默模板中扩增Es Dscam细胞外高变区
        2.10 统计学分析
    第三节 结果
        3.1 Es Dscam-hv的 RNA二级结构
        3.2 Es B52 基因的序列分析
        3.3 Es B52 的组织表达分析
        3.4 血细胞免疫刺激后Es B52 的表达模式分析
        3.5 Es B52 的体外沉默分析
        3.6 Es B52的体外沉默对Es Dscam细胞外高变异区域的影响
    第四节 讨论
第四章 Dock基因的免疫功能研究
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 实验动物
        2.2 样品采集及实验动物免疫刺激
        2.3 总RNA提取和第一链c DNA合成
        2.4 Es Dock cDNA的克隆
        2.5 Es Dock cDNA的生物信息学分析
        2.6 实时荧光定量PCR检测
        2.7 EsDock的体外干扰实验
        2.8 统计学分析
        2.9 免疫荧光实验
        2.10 Western Blot检测
    第三节 结果
        3.1 Es Dock基因的序列分析
        3.2 金黄色葡萄球菌刺激血细胞后Es Dock的表达
        3.3 Es Dock的体外沉默分析
        3.4 Es Dock的体外沉默对抗菌肽表达的影响
        3.5 金黄色葡萄球菌刺激下Es Dock能够诱导ERK信号分子激活
        3.6 金黄色葡萄球菌刺激下Es Dock调控Toll信号通路
    第四节 讨论
第五章 Dscam细胞质尾调控抗菌肽表达的分子机制
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 实验动物
        2.2 样品采集及实验动物免疫刺激
        2.3 实时荧光定量PCR检测
        2.4 Exon33、Exon35 的体外干扰实验
        2.5 统计学分析
        2.6 免疫荧光试验
        2.7 质粒构建及转染
        2.8 免疫共沉淀（Co-IP）实验
        2.9 Western Blot检测
    第三节 结果
        3.1 跨膜型Dscam细胞质尾可变剪接外显子体外沉默
        3.2 Exon33和Exon35 的体外沉默对抗菌肽表达的影响
        3.3 金黄色葡萄球菌刺激下Exon33和Exon35对ERK信号分子磷酸化的影响
        3.4 金黄色葡萄球菌刺激下Exon33和Exon35对Toll信号通路的影响
        3.5 跨膜型Es Dscam细胞质尾与Es Dock的结合
        3.6 Es Dock与 ERK分子的相互作用
    第四节 讨论
本研究的结论、特色与创新点、展望
参考文献
附录
致谢

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