海洋芽孢杆菌源脂肽CLPs抑制溶藻弧菌运动性分子机制研究

发布时间：2020-10-28 00:53

　　 运动性对于病原菌成功入侵宿主、定殖、并在宿主体内释放毒力因子具有重要作用,因此细菌运动性是一个新型药物筛选潜在的靶标。在木研究中,从雅浦海沟附近海域分离到了一株海洋溶藻弧菌Vibrio alginolyticus 178,该菌具有强烈的运动能力且对斑马鱼鱼有高致病性。以溶藻弧菌V. alginolytious 178作为对象,利用对峙培养法从相同生态位筛选得到一株抑制溶藻弧菌V.alginolyticus178运动的海洋细菌芽孢杆菌Bacillus sp. 176。采用盐酸沉淀、凝胶过滤层析、高效液相色谱等方法从芽孢杆菌Bacillus sp. 176的发酵液中分离得到了两个活性物质(CLP1和CLP2),运用氨基酸分析、质谱和核磁共振波谱的技术方法鉴定了这两个活性物质的结构。这两个活性物质是pumilacidin类的脂肽,分子量在脂肪链上相差一个亚甲基。除了能够抑制溶藻弧菌V.alginolyicus 178的运动外,活性脂肽(CLPs)能够明显降低溶藻弧菌对斑马鱼鱼的致病性,诱导细菌细胞的聚集沉降,并且降低溶藻弧菌V.alginolyticus 178在玻片上的黏附能力。此外,活性脂肽能够抑制其它病原菌生物膜的形成而不杀死病原菌。qRT-PCR实验结果表明,经过脂肽处理后,溶藻弧菌V.alginolyticus178的两个鞭毛合成组装基因(flgA和flgP)转录水平显著下调。本研究表明芽孢杆菌Bacillus sp. 176产生的活性脂肽能够抑制溶藻弧菌的运动性,具有作为新型抗菌先导化合物的潜力,靶向细菌的运动性和生物膜的形成而不产生抗生素耐性。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S941.4
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 弧菌
        1.1.1 溶藻弧菌的生物学特性
        1.1.2 溶藻弧菌的致病性与毒力因子
            1.1.2.1 黏附素
            1.1.2.2 外膜蛋白
            1.1.2.3 胞外产物
            1.1.2.4 脂多糖
            1.1.2.5 铁吸收系统
        1.1.3 弧菌病
        1.1.4 拮抗菌及其代谢产物抗弧菌研究
    1.2 鞭毛
        1.2.1 鞭毛细丝
        1.2.2 鞭毛基体
        1.2.3 鞭毛马达
        1.2.4 FlgA和FlgP蛋白
        1.2.5 FlhG和FlhF蛋白
        1.2.6 鞭毛组装
        1.2.7 鞭毛的基因调控
    1.3 芽孢杆菌脂肽
        1.3.1 芽孢杆菌脂肽的研究概况
            1.3.1.1 伊枯草菌素家族Iturins
            1.3.1.2 芬荠素家族Fengycins
            1.3.1.3 表面活性素家族Surfactins
        1.3.2 芽孢杆菌脂肽的分离与鉴定研究
            1.3.2.1 脂肽的定性检测
            1.3.2.2 脂肽的纯化与鉴定
    1.4 本论文研究目的与意义
第二章 实验材料
    2.1 菌株
    2.2 培养基
    2.3 实验试剂
    2.4 实验设备
第三章 实验方法
    3.1 溶藻弧菌的分离与鉴定
    3.2 溶藻弧菌的运动性
    3.3 溶藻弧菌的致病性
    3.4 菌株的分离、筛选与鉴定
        3.4.1 菌种库的扩充
        3.4.2 活性菌株的筛选
        3.4.3 菌株的鉴定
    3.5 活性物质的发酵优化及性质确定
        3.5.1 发酵条件的优化
        3.5.2 活性物质类型性质的确定
    3.6 活性物质的分离纯化
        3.6.1 菌株规模发酵培养
        3.6.2 粗提物的制备
        3.6.3 Sephadex LH-20凝胶过滤层析
        3.6.4 HPLC分离纯化
    3.7 活性物质的结构鉴定
        3.7.1 活性物质的氨基酸分析
        3.7.2 活性物质的质谱分析
        3.7.3 活性物质的核磁共振波谱分析
    3.8 活性物质对溶藻弧菌运动性的影响
        3.8.1 平板抑制实验
        3.8.2 生长状态曲线
    3.9 活性物质对溶藻弧菌致病性的影响
    3.10 活性物质对溶藻弧菌的聚集作用
        3.10.1 聚集效应
        3.10.2 溶藻弧菌形态变化
    3.11 活性物质对其他细菌聚集和生物膜的影响
    3.12 活性物质对溶藻弧菌黏附能力的影响
    3.13 活性物质对溶藻弧菌鞭毛形成相关基因转录的影响
        3.13.1 细菌总RNA提取
        3.13.2 cDNA合成
        3.13.3 qRT-PCR定量
第四章 结果与讨论
    4.1 溶藻弧菌的分离与鉴定
    4.2 溶藻弧菌的运动性
    4.3 溶藻弧菌的致病性
    4.4 菌株的分离、筛选与鉴定
        4.4.1 菌株的分离
        4.4.2 抑制运动性的筛选
        4.4.3 活性菌株的鉴定
    4.5 活性物质的发酵优化及性质确定
        4.5.1 发酵条件的优化
        4.5.2 活性物质类型性质的确定
    4.6 活性物质的分离纯化
        4.6.1 活性物质的发酵和粗提物制备
        4.6.2 Sephadex LH-20凝胶过滤层析
        4.6.3 HPLC分离纯化
    4.7 活性物质的结构鉴定
        4.7.1 活性物质的氨基酸分析
        4.7.2 活性物质的高分辨质谱分析
        4.7.3 活性物质的二级质谱分析
        4.7.4 活性物质的核磁共振波谱分析
    4.8 活性物质对溶藻弧菌运动性的影响
    4.9 活性物质对溶藻弧菌致病性的影响
    4.10 活性物质对溶藻弧菌的聚集沉降
        4.10.1 聚集效应
        4.10.2 溶藻弧菌形态变化
    4.11 活性物质对其他细菌聚集和生物膜的影响
    4.12 活性物质对溶藻弧菌黏附能力的影响
    4.13 活性物质对溶藻弧菌鞭毛形成相关基因表达的影响
    4.14 讨论
第五章 结论
参考文献
附录 1
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文

【参考文献】

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本文编号：2859327