半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）非特异性免疫相关基因SAP和PTX1的克

发布时间：2020-10-30 22:56

　　 非特异性免疫是机体抵抗外源病原菌入侵的第一道防线,同时在清除病原菌、修复损伤组织、激活和调节特异性免疫应答反应等方面发挥着重要作用。非特异性免疫系统由细胞免疫和体液免疫组成,体液免疫系统中最重要的组成成分是能识别病原体相关分子模式的体液模式识别分子。在哺乳动物中,血清淀粉样P成分(serum amyloid P component,SAP)和正五聚蛋白-1(pentraxin-1,PTX1)作为经典的体液模式识别分子,拥有进化上保守的功能,如激活和调控补体级联反应,发挥凝集、中和和调理作用,调节炎症反应等。然而,目前有关鱼类SAP和PTX1的功能研究十分有限,特别是免疫功能研究。在本论文中,我们克隆了半滑舌鳎SAP(CsSAP)和PTX1(CsPTX1)基因,分析了它们在mRNA水平上的表达变化情况,并检测了CsSAP和CsPTX1重组蛋白(rCsSAP和rCsPTX1)的抗细菌和抗病毒免疫作用。CsSAP的开放性阅读框有672个碱基,共编码224个氨基酸。CsSAP与已知鱼类的SAP样蛋白有46%-58%的序列相似性,且在细菌和病毒感染的情况下表达量显著上调。功能研究结果表明,rCsSAP能结合多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,且这种结合活性有蛋白浓度依赖性和菌种特异性。体外实验发现rCsSAP结合细菌后,能显著增强宿主吞噬细胞的吞噬活性。体内组织侵染实验发现,rCsSAP能有效帮助宿主抵抗细菌和病毒感染。与此相反,特异性抗体封闭宿主体内天然的CsSAP后,半滑舌鳎清除入侵细菌的能力显著降低。这些结果首次证明了鱼类的SAP蛋白在宿主抗细菌和抗病毒免疫反应中发挥着重要作用。CsPTX1蛋白包含223个氨基酸,与其它已知鱼类的正五聚蛋白有38.8%-49.3%的序列相似性。正常生理条件下,CsPTX1在多个组织中均有表达,且在细菌和病毒感染的情况下表达量显著上调。由于CsPTX1包含一个能结合胞外抗原的正五聚蛋白结构域,因此rCsPTX1能与多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌相互作用。同时,rCsPTX1也能以钙依赖的方式使细菌发生凝集。体外实验发现,rCsPTX1对细菌包膜的渗透性有一定的影响,进而抑制荧光假单胞菌的生长和增殖。体内组织侵染实验发现,rCsPTX1能有效帮助宿主抵抗细菌感染。上述结果表明,CsPTX1作为经典的模式识别分子,能促进半滑舌鳎抗细菌感染,在宿主非特异性免疫反应中发挥着重要作用。
【学位单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：Q78;S917.4
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第一章 绪论
    第一节 鱼类的非特异性免疫系统
        1.1 细胞免疫
            1.1.1 吞噬细胞
            1.1.2 非特异性细胞毒性细胞
            1.1.3 上皮细胞和树突状细胞
        1.2 体液免疫
            1.2.1 细胞相关受体
            1.2.2 体液可溶性分子
        1.3 鱼类的免疫组织和器官
            1.3.1 胸腺
            1.3.2 头肾
            1.3.3 脾脏
            1.3.4 黏膜相关淋巴组织
    第二节 正五聚体蛋白在非特异性免疫系统中的作用
    第三节 SAP和PTX1的研究现状
        3.1 SAP和PTX1的发现及分子特征
        3.2 SAP的功能研究
        3.3 PTX1的功能研究
    第四节 本研究的目的和意义
第二章 半滑舌鳎重组CsSAP的抗菌、抗病毒作用研究
    第一节 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物半滑舌鳎
            1.1.2 实验菌株（如下表）
            1.1.3 实验病毒株
            1.1.4 实验主要试剂和仪器设备
            1.1.5 实验中涉及的分析软件
        1.2 实验方法
            1.2.1 正常生理条件下各组织中CsSAP的表达
            1.2.2 细菌、病毒感染后CsSAP的表达变化
            1.2.3 构建表达CsSAP重组蛋白（rCsSAP）的原核表达载体
            1.2.4 诱导表达、纯化rCsSAP
            1.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测rCsSAP与细菌间的相互作用
            1.2.6 免疫荧光显微镜术验证rCsSAP对荧光假单胞菌的结合作用
            1.2.7 流式细胞术检测rCsSAP对外周血淋巴细胞吞噬活性的影响
            1.2.8 组织侵染实验检测rCsSAP对半滑舌鳎抗细菌、抗病毒免疫的影响
            1.2.9 抗体封闭CsSAP对半滑舌鳎抗细菌免疫的影响
    第二节 实验结果
        2.1 CsSAP序列分析
        2.2 CsSAP基因的组成型表达谱
        2.3 细菌、病毒感染后CsSAP基因在免疫组织中的表达
        2.4 rCsSAP重组蛋白结合革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌
        2.5 rCsSAP-细菌复合物影响宿主外周血淋巴细胞的吞噬活性
        2.6 rCsSAP对舌鳎抗细菌和抗病毒的作用
        2.7 抗体封闭CsSAP对舌鳎抗细菌免疫反应的作用
    第三节 讨论
    第四节 小结
第三章 半滑舌鳎CsPTX1的免疫功能研究
    第一节 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验步骤
            1.2.1 生物信息学软件分析CsPTX1基因序列
            1.2.2 聚合酶链式反应扩增CsPTX1基因
            1.2.3 qRT-PCR检测CsPTX1基因的组成型表达
            1.2.4 qRT-PCR检测细菌、病毒刺激后CsPTX1基因的表达变化
            1.2.5 构建表达CsPTX1重组蛋白（rCsPTX1）的原核表达载体
            1.2.6 诱导表达、纯化重组CsPTX1蛋白（rCsPTX1）
            1.2.7 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测rCsPTX1对细菌的结合活性
            1.2.8 rCsPTX1凝集细菌实验
            1.2.9 体外抑菌实验检测rCsPTX1对细菌的影响
            1.2.10 扫描电镜检测细菌形态变化
            1.2.11 组织侵染实验检测rCsPTX1对舌鳎抗细菌感染的影响
    第二节 实验结果
        2.1 CsPTX1序列分析
        2.2 正常生理条件下CsPTX1基因的组成型表达谱
        2.3 细菌、病毒刺激后CsPTX1基因在免疫组织中的表达
        2.4 rCsPTX1结合革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌
        2.5 rCsPTX1凝集革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌
        2.6 rCsPTX1对细菌体外增殖和生存的影响
        2.7 rCsPTX1对细菌形态的影响
        2.8 rCsPTX1对舌鳎抗细菌免疫反应的影响
    第三节 讨论
    第四节 小结
参考文献
个人简历
发表论文与研究成果

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本文编号：2863111