凡纳滨对虾TOR信号通路及其2个重要成员的功能研究
发布时间：2020-11-06 01:13
本文以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,对与其生长代谢密切相关的TOR(Target of Rapamycin)信号通路在基因水平以及蛋白水平上进行了初步的研究,以期能够在未来对虾的生产实践中提供理论依据。为探究TOR信号通路调节的细胞过程,将雷帕霉素(TOR信号通路抑制剂)直接注射到凡纳滨对虾的肌肉组织,利用转录组测序技术分析了对虾肌肉组织基因表达水平的变化,发现许多差异表达基因都与细胞自噬过程相关,推测TOR信号通路抑制参与调控凡纳滨对虾的细胞自噬过程。这些基因包括自噬相关基因、凋亡相关基因、Ca2+调节相关基因、热休克蛋白(hsps)基因、p53基因以及许多溶酶体功能基因。利用Western Blot技术发现在凡纳滨对虾中,雷帕霉素能够有效抑制TOR信号通路,促进细胞自噬。此外,在TOR信号通路受到抑制从而引发自噬的过程中,与自噬起始密切相关的ATG1和ATG13蛋白的磷酸化水平都显著下降。利用RACE技术首次在凡纳滨对虾中克隆得到了rheb基因,全长898 bp,开放阅读框549 bp,共编码182个氨基酸。利用qRT-PCR技术进行该基因的组织特异性表达分析,发现该基因在所有组织中都表达,在肠道中的表达量最低。分析饥饿、氨基酸注射以及雷帕霉素注射等不同处理条件下基因表达的差异,发现饥饿与雷帕霉素都可以促进rheb的表达,而亮氨酸或精氨酸的注射可以使饥饿引起的rheb表达量变化恢复到正常水平,但是对雷帕霉素引起的rheb表达量变化却没有影响。分析了TOR信号通路中另一个重要基因raptor在饥饿、氨基酸注射以及雷帕霉素注射等不同的处理方式下的表达变化,发现饥饿与雷帕霉素都可以促进raptor的表达,而氨基酸的注射可以缓解饥饿和雷帕霉素注射对raptor表达量的影响。通过对raptor基因的RNA干扰,发现S6K与4EBP蛋白的磷酸化与Raptor蛋白密切相关,并且4EBP的磷酸化过程要比S6K更加依赖Raptor蛋白。鉴于目前针对水产动物营养与代谢分子调控机制的研究报道较少,尤其在甲壳动物中的研究更为罕见。上述结果一方面加深了我们对甲壳动物TOR信号通路的认知,有助于了解对虾等经济动物生长与代谢的分子机理以及揭示TOR信号通路在生命进化过程中的衍化痕迹。另外,从分子水平上探索对虾生长代谢调控的机理,为苗种的选育、饲料营养成分添加配比以及优化养殖管理模式提供了理论依据。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
期的研究中人们发现 TOR 蛋白并不是单独存在，而是形成两种不同的蛋白体来行使其功能（Cafferkey et al.，1993；Kunzet al.，1993）。这两种蛋白复分别是 TORC1 和 TORC2，它们都有 TOR、mLST8（Jacinto et al.，2004； et al.，2003）、Deptor（Li et al.，2014）和 Tti1/Tel2（Kaizuka et al.，2010），其中 TORC1 还含有 Raptor（Kenta et al.，2002）和 PPRAS40（Sancak et al.7）蛋白，而 Rictor（Sarbassov et al.，2004）、mSIN1（Jacinto et al.，2006）rotor1/2（Thedieck et al.，2007）蛋白为 TORC2 蛋白复合体特有。在机体细胞中，TOR 信号通路能够接收营养素、生长因子、氧浓度、环境等多种外部信号来调节自身的多种细胞过程，从而实现对生命过程的精确调尽管对 TOR 信号通路的研究已经近 30 年，对其研究也取得了很多的成果 TOR 信号通路的具体作用机制仍然有待发掘。至今，研究较深入的可被 TO通路调节的细胞过程包括生物大分子合成、自噬、细胞周期、细胞生长代谢骨架以及细胞的寿命。
20图 2.1 凡纳滨对虾应答雷帕霉素注射的差异表达基因 GO 分类Fig 2.1 GO categories analysis of the differently-expressed genes of Litopenaeus vannameiresponding to rapamycin injection
c39702.graph_c0 slc17a5partial [Stegodyphus mimosarum]upc43518.graph_c0 galnshypothetical proteinCAPTEDRAFT_152949 [Capitella teleta]upc36969.graph_c0 asah1hypothetical proteinDAPPUDRAFT_306210 [Daphnia pulex]upc39730.graph_c0 cd63tetraspanins-like protein [Penaeusmonodon]up2.3.7 转录组分析结果的验证为确定转录组分析结果的准确性，每组随机挑选 10 个差异基因进行qRT-PCR 验证。qRT-PCR 验证结果与转录组测序结果一致（图 2.2）。以上结果证实了高通量转录组测序数据和生物信息学分析的准确性以及筛选差异表达基因的可靠性。
【参考文献】
本文编号：2872456
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
期的研究中人们发现 TOR 蛋白并不是单独存在，而是形成两种不同的蛋白体来行使其功能（Cafferkey et al.，1993；Kunzet al.，1993）。这两种蛋白复分别是 TORC1 和 TORC2，它们都有 TOR、mLST8（Jacinto et al.，2004； et al.，2003）、Deptor（Li et al.，2014）和 Tti1/Tel2（Kaizuka et al.，2010），其中 TORC1 还含有 Raptor（Kenta et al.，2002）和 PPRAS40（Sancak et al.7）蛋白，而 Rictor（Sarbassov et al.，2004）、mSIN1（Jacinto et al.，2006）rotor1/2（Thedieck et al.，2007）蛋白为 TORC2 蛋白复合体特有。在机体细胞中，TOR 信号通路能够接收营养素、生长因子、氧浓度、环境等多种外部信号来调节自身的多种细胞过程，从而实现对生命过程的精确调尽管对 TOR 信号通路的研究已经近 30 年，对其研究也取得了很多的成果 TOR 信号通路的具体作用机制仍然有待发掘。至今，研究较深入的可被 TO通路调节的细胞过程包括生物大分子合成、自噬、细胞周期、细胞生长代谢骨架以及细胞的寿命。
20图 2.1 凡纳滨对虾应答雷帕霉素注射的差异表达基因 GO 分类Fig 2.1 GO categories analysis of the differently-expressed genes of Litopenaeus vannameiresponding to rapamycin injection
c39702.graph_c0 slc17a5partial [Stegodyphus mimosarum]upc43518.graph_c0 galnshypothetical proteinCAPTEDRAFT_152949 [Capitella teleta]upc36969.graph_c0 asah1hypothetical proteinDAPPUDRAFT_306210 [Daphnia pulex]upc39730.graph_c0 cd63tetraspanins-like protein [Penaeusmonodon]up2.3.7 转录组分析结果的验证为确定转录组分析结果的准确性，每组随机挑选 10 个差异基因进行qRT-PCR 验证。qRT-PCR 验证结果与转录组测序结果一致（图 2.2）。以上结果证实了高通量转录组测序数据和生物信息学分析的准确性以及筛选差异表达基因的可靠性。
【参考文献】
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本文编号：2872456
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