大黄鱼过氧化物酶Ⅳ的抗氧化活性与其互作蛋白的初步研究
发布时间：2021-04-23 17:06
大黄鱼的过氧化物酶IV（Peroxiredoxin IV,Lyc-PrxIV）是一种N端带有信号肽的典型2-半胱氨酸过氧化物酶,常分泌到细胞外,存在于血浆,在胞内则存在于内质网中。在细胞中的作用主要有抗氧化,调节细胞内过氧化氢介导的信号传导,参与细胞的增殖、分裂和周期进程,促进血红素的代谢,并可作为分子伴侣参与细胞损伤后修复和氧化应激反应。为了研究Lyc-PrxIV在体内是否具有抗氧化功能,我们构建了表达Lyc-PrxIV的重组质粒pCMV-Lyc-PrxIV,瞬时转染人胚肾细胞HEK-293T,利用Western blot方法检测转染后的细胞样品中Lyc-PrxIV的表达情况,并通过测定细胞内过氧化氢浓度来评价Lyc-PrxIV的体内抗氧化作用。结果显示,Lyc-PrxIV可在转染重组质粒pCMV-Lyc-PrxIV的HEK-293T细胞中表达,且细胞中过氧化氢的浓度在转染后6 h、12 h、24 h时明显低于瞬时转染空载体pCMV细胞中的过氧化氢浓度（P<0.01）。表明Lyc-PrxIV在生物体内可以分解过氧化氢,参与生物体内氧化还原反应的调控。为了进一步了解Lyc-Prx...
【文章来源】：集美大学福建省
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 前言
1.1 大黄鱼简介及其病害
1.1.1 养殖鱼类主要病害
1.2 生物体的抗氧化系统
1.2.1 超氧化物歧化酶
1.2.2 过氧化氢酶
1.2.3 硫氧还原蛋白
1.2.4 谷胱甘肽系统
1.2.5 过氧化物酶（Peroxiredoxin）家族
1.3 酵母双杂交
1.3.1 酵母双杂交概述
1.3.2 酵母双杂交作用原理
1.3.3 酵母双杂交系统的优缺点
1.4 免疫共沉淀技术
1.5 启动子概述
1.6 本论文研究的目的和意义
第2章 大黄鱼过氧化物酶IV在HEK-293T细胞中的表达与抗氧化活性测定
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌株和质粒
2.1.3 酶类以及主要试剂
2.1.4 主要引物合成
2.1.5 主要仪器设备
2.1.6 常用培养基和溶液
2.2 实验方法
2.2.1 高糖DMEM培养基的配制
2.2.2 细胞传代培养
2.2.3 细胞冻存
2.2.4 细胞复苏
2.2.5 Trizol法提总RNA
2.2.6 RNA中基因组DNA的消化去除
2.2.7 逆转录反应
2.2.8 表达载体的构建
2.2.9 制备大肠杆菌E.coli感受态细胞
2.2.10 连接反应
2.2.11 转化及菌落PCR的筛选
2.2.12 去内毒素试剂盒抽提质粒DNA
2.2.13 质粒DNA转染HEK-293T细胞
2.2.14 细胞裂解
2.2.15 Western blot
2.2.16 重组蛋白Lyc-PrxIV在HEK-293T细胞中的抗氧化活性分析
2.3 实验结果
2.3.1 大黄鱼脾脏cDNA的制备及Lyc-PrxIV目的片段的PCR扩增
2.3.2 重组质粒pCMV-Lyc-PrxIV的构建
2.3.3 Lyc-PrxIV在HEK-293T细胞中的表达
2.3.4 重组蛋白Lyc- PrxIV在HK-293T细胞中的抗氧化活性分析
2.4 讨论
第3章 大黄鱼过氧化物酶IV互作蛋白筛选及验证
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物
3.1.2 菌株和质粒
3.1.3 酶类以及主要试剂
3.1.4 主要引物合成
3.1.5 主要仪器设备
3.1.6 常用培养基和溶液
3.2 试验方法
3.2.1 表达载体的构建
3.2.2 酵母感受态细胞的制备
3.2.3 诱饵质粒DNA的转化
3.2.4 诱饵质粒DNA在酵母菌株中自激活检测
3.2.5 酵母双杂交文库转化和筛选
3.2.6 X-gal显色实验
3.2.7 酵母质粒的提取
3.2.8 细胞转染
3.2.9 细胞裂解
3.2.10免疫共沉淀
3.2.11 Western blot
3.3 实验结果
3.3.1 诱饵质粒的毒性及自激活检测
3.3.2 阳性克隆的筛选和鉴定
3.3.3 免疫共沉淀
3.4 讨论
第4章 大黄鱼过氧化物酶IV启动子活性分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物
4.1.2 菌株、载体和细胞
4.1.3 主要试剂
4.1.4 引物合成
4.1.5 主要仪器设备
4.1.6 常用溶液和培养基
4.2 实验方法
4.2.1 用Genome Walker试剂盒扩增Lyc-PrxIV的 5’调控序列
4.2.2 构建含Lyc-PrxIV的 5’调控序列和报告基因的重组质粒
4.2.3 Lyc-PrxIV的 5’调控序列的活性验证
4.2.4 Lyc-PrxIV启动子的免疫刺激分析
4.2.5 Lyc-PrxIV启动子的删除截短活性分析
4.2.6 数据分析
4.3 结果与分析
4.3.1 用Genome Walker试剂盒扩增Lyc-PrxIV的 5’调控序列
4.3.2 Lyc-PrxIV的 5’调控序列活性分析
4.3.3 Lyc-PrxIV启动子对免疫刺激的响应分析
4.3.4 不同长度Lyc-PrxIV启动子活性分析
4.4 讨论
第5章 总结与展望
5.1 总结
5.2 展望
致谢
参考文献
在学期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]《2013中国渔业统计年鉴》解读[J]. 董金和. 中国水产. 2013(07)
[2]通过对免疫共沉淀技术的优化验证蛋白质弱相互作用[J]. 冯晓琴,徐峰,王嵬,刘利新. 中国科学院研究生院学报. 2013(01)
[3]蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较[J]. 涂占晗,林旭. 中国当代医药. 2012(14)
[4]小鼠基因内含子中CpG岛和几个转录调控元件分析[J]. 李慧敏,陈丹. 基因组学与应用生物学. 2012(02)
[5]鸡法氏囊B淋巴细胞中与鸡传染性法氏囊病病毒VP2相互作用蛋白筛选[J]. 高玉龙,孙芬芬,侯磊,高宏雷,祁小乐,刘娣,华育平,王笑梅. 生物工程学报. 2011(04)
[6]2-Cys peroxiredoxins的生物学功能以及化学物质对其的影响[J]. 韦潇湘,李习艺. 毒理学杂志. 2011(02)
[7]微生物过氧化氢酶的发酵生产及其在纺织工业的应用[J]. 张东旭,堵国成,陈坚. 生物工程学报. 2010(11)
[8]低温选择大黄鱼（Pseudosciaena crocea）的肝脏蛋白质组双向电泳分析[J]. 李明云,吴玉珍,冀德伟,吴海庆,陈炯,史雨红,罗海忠,柳敏海,傅荣兵. 海洋与湖沼. 2010(03)
[9]PDIA3的结构与功能及其在精卵融合过程中的作用[J]. 吕利霞,汤睿智,邢万金. 生物技术通报. 2010(03)
[10]Prx4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 唐光华,倪润洲,陈健华,黄华. 航空航天医药. 2009(10)
博士论文
[1]养殖大黄鱼和野生大黄鱼风味的研究[D]. 翁丽萍.浙江工商大学 2012
[2]人类基因组转录调节模体距离保守性的研究与转录起始位点的预测[D]. 吕军.内蒙古大学 2008
硕士论文
[1]小鼠GSTK1基因启动子调控机制的初步研究[D]. 胡文秀.苏州大学 2012
[2]STGC3基因启动子的初步分析及鉴定[D]. 王莉莉.南华大学 2012
[3]大黄鱼脾脏转录组和表达谱分析以及过氧化物酶4结构与功能研究[D]. 母尹楠.国家海洋局第三海洋研究所 2011
[4]脂多糖结合蛋白（LBP）与过氧化物酶-4（Prx4）相互作用的研究[D]. 吴琼.湖北大学 2011
[5]草鱼干扰素及其调节因子1和7[D]. 马梅生.南昌大学 2010
[6]大黄鱼CXCL13型趋化因子的鉴定及免疫球蛋白M重链和轻链的分子特征研究[D]. 田琛.国家海洋局第三海洋研究所 2009
[7]人PRL-3基因启动子的生物信息学分析及初步研究[D]. 杨发达.第一军医大学 2007
[8]用酵母双杂交系统筛选与nicastrin相互作用蛋白的初步研究[D]. 黄秀梅.厦门大学 2007
本文编号：3155706
【文章来源】：集美大学福建省
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 前言
1.1 大黄鱼简介及其病害
1.1.1 养殖鱼类主要病害
1.2 生物体的抗氧化系统
1.2.1 超氧化物歧化酶
1.2.2 过氧化氢酶
1.2.3 硫氧还原蛋白
1.2.4 谷胱甘肽系统
1.2.5 过氧化物酶（Peroxiredoxin）家族
1.3 酵母双杂交
1.3.1 酵母双杂交概述
1.3.2 酵母双杂交作用原理
1.3.3 酵母双杂交系统的优缺点
1.4 免疫共沉淀技术
1.5 启动子概述
1.6 本论文研究的目的和意义
第2章 大黄鱼过氧化物酶IV在HEK-293T细胞中的表达与抗氧化活性测定
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌株和质粒
2.1.3 酶类以及主要试剂
2.1.4 主要引物合成
2.1.5 主要仪器设备
2.1.6 常用培养基和溶液
2.2 实验方法
2.2.1 高糖DMEM培养基的配制
2.2.2 细胞传代培养
2.2.3 细胞冻存
2.2.4 细胞复苏
2.2.5 Trizol法提总RNA
2.2.6 RNA中基因组DNA的消化去除
2.2.7 逆转录反应
2.2.8 表达载体的构建
2.2.9 制备大肠杆菌E.coli感受态细胞
2.2.10 连接反应
2.2.11 转化及菌落PCR的筛选
2.2.12 去内毒素试剂盒抽提质粒DNA
2.2.13 质粒DNA转染HEK-293T细胞
2.2.14 细胞裂解
2.2.15 Western blot
2.2.16 重组蛋白Lyc-PrxIV在HEK-293T细胞中的抗氧化活性分析
2.3 实验结果
2.3.1 大黄鱼脾脏cDNA的制备及Lyc-PrxIV目的片段的PCR扩增
2.3.2 重组质粒pCMV-Lyc-PrxIV的构建
2.3.3 Lyc-PrxIV在HEK-293T细胞中的表达
2.3.4 重组蛋白Lyc- PrxIV在HK-293T细胞中的抗氧化活性分析
2.4 讨论
第3章 大黄鱼过氧化物酶IV互作蛋白筛选及验证
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物
3.1.2 菌株和质粒
3.1.3 酶类以及主要试剂
3.1.4 主要引物合成
3.1.5 主要仪器设备
3.1.6 常用培养基和溶液
3.2 试验方法
3.2.1 表达载体的构建
3.2.2 酵母感受态细胞的制备
3.2.3 诱饵质粒DNA的转化
3.2.4 诱饵质粒DNA在酵母菌株中自激活检测
3.2.5 酵母双杂交文库转化和筛选
3.2.6 X-gal显色实验
3.2.7 酵母质粒的提取
3.2.8 细胞转染
3.2.9 细胞裂解
3.2.10免疫共沉淀
3.2.11 Western blot
3.3 实验结果
3.3.1 诱饵质粒的毒性及自激活检测
3.3.2 阳性克隆的筛选和鉴定
3.3.3 免疫共沉淀
3.4 讨论
第4章 大黄鱼过氧化物酶IV启动子活性分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物
4.1.2 菌株、载体和细胞
4.1.3 主要试剂
4.1.4 引物合成
4.1.5 主要仪器设备
4.1.6 常用溶液和培养基
4.2 实验方法
4.2.1 用Genome Walker试剂盒扩增Lyc-PrxIV的 5’调控序列
4.2.2 构建含Lyc-PrxIV的 5’调控序列和报告基因的重组质粒
4.2.3 Lyc-PrxIV的 5’调控序列的活性验证
4.2.4 Lyc-PrxIV启动子的免疫刺激分析
4.2.5 Lyc-PrxIV启动子的删除截短活性分析
4.2.6 数据分析
4.3 结果与分析
4.3.1 用Genome Walker试剂盒扩增Lyc-PrxIV的 5’调控序列
4.3.2 Lyc-PrxIV的 5’调控序列活性分析
4.3.3 Lyc-PrxIV启动子对免疫刺激的响应分析
4.3.4 不同长度Lyc-PrxIV启动子活性分析
4.4 讨论
第5章 总结与展望
5.1 总结
5.2 展望
致谢
参考文献
在学期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]《2013中国渔业统计年鉴》解读[J]. 董金和. 中国水产. 2013(07)
[2]通过对免疫共沉淀技术的优化验证蛋白质弱相互作用[J]. 冯晓琴,徐峰,王嵬,刘利新. 中国科学院研究生院学报. 2013(01)
[3]蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较[J]. 涂占晗,林旭. 中国当代医药. 2012(14)
[4]小鼠基因内含子中CpG岛和几个转录调控元件分析[J]. 李慧敏,陈丹. 基因组学与应用生物学. 2012(02)
[5]鸡法氏囊B淋巴细胞中与鸡传染性法氏囊病病毒VP2相互作用蛋白筛选[J]. 高玉龙,孙芬芬,侯磊,高宏雷,祁小乐,刘娣,华育平,王笑梅. 生物工程学报. 2011(04)
[6]2-Cys peroxiredoxins的生物学功能以及化学物质对其的影响[J]. 韦潇湘,李习艺. 毒理学杂志. 2011(02)
[7]微生物过氧化氢酶的发酵生产及其在纺织工业的应用[J]. 张东旭,堵国成,陈坚. 生物工程学报. 2010(11)
[8]低温选择大黄鱼（Pseudosciaena crocea）的肝脏蛋白质组双向电泳分析[J]. 李明云,吴玉珍,冀德伟,吴海庆,陈炯,史雨红,罗海忠,柳敏海,傅荣兵. 海洋与湖沼. 2010(03)
[9]PDIA3的结构与功能及其在精卵融合过程中的作用[J]. 吕利霞,汤睿智,邢万金. 生物技术通报. 2010(03)
[10]Prx4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 唐光华,倪润洲,陈健华,黄华. 航空航天医药. 2009(10)
博士论文
[1]养殖大黄鱼和野生大黄鱼风味的研究[D]. 翁丽萍.浙江工商大学 2012
[2]人类基因组转录调节模体距离保守性的研究与转录起始位点的预测[D]. 吕军.内蒙古大学 2008
硕士论文
[1]小鼠GSTK1基因启动子调控机制的初步研究[D]. 胡文秀.苏州大学 2012
[2]STGC3基因启动子的初步分析及鉴定[D]. 王莉莉.南华大学 2012
[3]大黄鱼脾脏转录组和表达谱分析以及过氧化物酶4结构与功能研究[D]. 母尹楠.国家海洋局第三海洋研究所 2011
[4]脂多糖结合蛋白（LBP）与过氧化物酶-4（Prx4）相互作用的研究[D]. 吴琼.湖北大学 2011
[5]草鱼干扰素及其调节因子1和7[D]. 马梅生.南昌大学 2010
[6]大黄鱼CXCL13型趋化因子的鉴定及免疫球蛋白M重链和轻链的分子特征研究[D]. 田琛.国家海洋局第三海洋研究所 2009
[7]人PRL-3基因启动子的生物信息学分析及初步研究[D]. 杨发达.第一军医大学 2007
[8]用酵母双杂交系统筛选与nicastrin相互作用蛋白的初步研究[D]. 黄秀梅.厦门大学 2007
本文编号：3155706
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