迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统EsaG/Orf13/EsaH复合物的晶体结构研究

发布时间：2021-05-14 03:14

　　迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda,E.tarda）是重要的革兰氏阴性致病菌,其宿主范围极广,可以感染鱼类、两栖类、爬行类、哺乳动物以及人类,最常见的宿主是鱼类。E.tarcda既能感染咸水鱼也能感染淡水鱼,是水产养殖中常见病原菌,它能使鱼类患爱德华氏菌病（Edwardsiellosis）,每年都会给水产养殖业带来巨大的经济损失。目前对于爱德华氏菌病的防治以化学防治法为主,虽然有多个课题组致力于爱德华氏菌病疫苗的研究,但目前都没有商业化的疫苗可用。Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ Secretion System,T3SS）广泛存在于动植物革兰氏阴性病原菌中,病原菌利用T3SS将毒力蛋白（effectors,效应蛋白）“注射”到宿主细胞的细胞质内,干扰宿主的正常生理活动。T3SS是E.tarda重要的致病因子,E.tarda利用T3SS将效应蛋白输送到鱼体细胞内,使鱼类患败血病死亡。T3SS的针状结构由超过100个needle蛋白构成。研究表明,T3SS的针状结构是由needle蛋白的C端通过疏水相互作用有规律地聚集组装而成。EsaG是组装迟缓爱德华氏菌T3SS针状结构的基... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 迟缓爱德华氏菌
    1.3 Ⅲ型分泌系统概述
    1.4 Ⅲ型分泌系统的分子伴侣
    1.5 Ⅲ型分泌系统的结构研究进展
        1.5.1 Ⅲ型分泌系统的结构概述
        1.5.2 Needle和Needle蛋白
        1.5.3 Needle蛋白与其分子伴侣复合物
    1.6 蛋白质相互作用的检测
        1.6.1 酵母双杂交
        1.6.2 GST pull down
    1.7 结构生物学
        1.7.1 结构生物学概述
        1.7.2 蛋白质结晶
        1.7.3 晶体数据收集
        1.7.4 晶体结构解析
    1.8 本研究的背景、目的与意义
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
    2.2 生物信息学分析
    2.3 酵母双杂交
    2.4 表达载体构建
    2.5 蛋白表达与纯化
        2.5.1 蛋白表达与亲和纯化
        2.5.2 Orf13/EsaH复合物表达与纯化
        2.5.3 硒代蛋白的表达与纯化
        2.5.4 EsaG~(33-73)/Orf13/EsaH复合物表达与纯化
    2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
        2.6.1 SDS-PAGE
        2.6.2 Tricine-SDS-PAGE
    2.7 结晶条件筛选与晶体优化
        2.7.1 结晶条件的初筛
        2.7.2 晶体的优化
    2.8 数据收集与结构解析
        2.8.1 衍射数据收集
        2.8.2 数据处理
        2.8.3 结构解析
3 实验结果
    3.1 生物信息学分析
        3.1.1 结构域分析
        3.1.2 二级结构预测
    3.2 酵母双杂交
    3.3 蛋白表达纯化
        3.3.1 融合蛋白表达纯化
        3.3.2 Orf13/EsaH表达纯化
        3.3.3 EsaG/Orf13/EsaH复合物表达纯化
    3.4 结晶条件筛选与晶体优化
        3.4.1 Orf13/EsaH复合物结晶条件筛选与晶体优化
        3.4.2 EsaG/Orf13/EsaH复合物结晶条件筛选与晶体优化
    3.5 衍射数据收集与处理
    3.6 晶体结构解析与修正
        3.6.1 晶胞内容分析
        3.6.2 晶体结构解析
    3.7 Orf13/EsaH复合物晶体结构
    3.8 EsaG/Orf13/EsaH复合物晶体结构
4 讨论
    4.1 酵母双杂交实验结果讨论
    4.2 EsaH的生物学功能
    4.3 EsaG~(33-54)是否在晶体中
    4.4 潜在的药物设计价值
    4.5 研究展望
参考文献
附录Ⅰ 溶液配制
附录Ⅱ 分子克隆反应体系
附录Ⅲ 数据收集与结构修正统计信息
致谢



本文编号：3185161