青虾几丁质酶基因全长cDNA序列的克隆及时空表达分析

发布时间：2022-02-21 00:01

　　青虾,学名日本沼虾（Macrobrachium nipponensis）,俗称河虾,是我国重要的淡水养殖品种。2012年的养殖产量达到了237,431吨,年产值超过150亿。青虾的生长、发育以及交配繁殖都与蜕壳（蜕皮）紧密相关。几丁质酶是在甲壳动物蜕壳过程中起着重要的作用的几种酶之一,与β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶联合作用将几丁质聚合物水解成为几丁质单体,从而使旧的外壳脱落。除在蜕壳过程中发挥作用外,几丁质酶还具有多种生物学作用,如食物消化、围食膜的降解、免疫反应等。鉴于几丁质酶基因在甲壳动物中的作用,且在青虾中至今没有研究报道。因此,本文拟克隆出青虾的几丁质酶家族基因,并将它们进行系统分类和命名。通过研究它们的分子特征、组织分布、胚后发育以及在蜕壳周期过程中的时空表达模式,结合不同温度下各几丁质酶基因的表达情况,进而推断出这些基因可能的生物学功能。本文从本实验室构建的青虾精巢文库中筛选到28条几丁质酶基因的EST序列,将这些EST序列拼接后获得5个几丁质酶基因的中间序列,此外还通过同源克隆的方法获得1个几丁质酶基因的中间序列。采用快速扩增cDNA末端（rapid-amplificatio... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    第一节 几丁质酶及甲壳动物蜕壳相关研究概况
        1 几丁质
            1.1 几丁质聚合物的结构特征
                1.1.1 α型几丁质
                1.1.2 β型几丁质
                1.1.3 γ型几丁质
            1.2 几丁质在节肢动物中的分布特征
            1.3 几丁质的降解
        2 几丁质酶及其分类
            2.1 几丁质酶
            2.2 几丁质酶的分类
                2.2.1 基于几丁质酶氨基酸序列同源性的分类
                2.2.2 基于水解后初级产物类型的分类
                2.2.3 基于几丁质酶活性的分类
        3 甲壳动物蜕壳及其调控的研究
            3.1 甲壳动物的蜕壳类型
                3.1.1 变态蜕壳
                3.1.2 生长蜕壳
                3.1.3 再生蜕壳
                3.1.4 生殖蜕壳
            3.2 甲壳动物的蜕壳周期
            3.3 影响甲壳动物蜕壳的环境因素
                3.3.1 温度对甲壳动物蜕壳的影响
                3.3.2 盐度对甲壳动物蜕壳的影响
                3.3.3 重金属离子对甲壳动物蜕壳的影响
            3.4 甲壳动物蜕壳的调控
    第二节 几丁质酶基因的研究进展
        1 几丁质酶基因研究概况
            1.1 昆虫几丁质酶基因
            1.2 甲壳动物几丁质酶基因
        2 几丁质酶基因编码的氨基酸序列结构特征
            2.1 催化结构域
            2.2 S/T富集的连接区
            2.3 几丁质结合结构域
        3 几丁质酶基因表达的调控
            3.1 几丁质酶基因的组织分布和表达模式
            3.2 几丁质酶基因的表达量和酶活性的周期性变化
            3.3 几丁质酶基因的表达受到激素的调控
        4 几丁质酶的功能研究
            4.1 在蜕壳反应中的作用
            4.2 在免疫学中的作用
            4.3 在消化反应中的作用
    第三节 本研究的目的与意义
第二章 青虾六个几丁质酶基因的克隆及序列分析
    1 实验材料
        1.1 实验虾
        1.2 试剂
        1.3 仪器
    2 实验方法
        2.1 青虾总RNA的提取
            2.1.1 实验用品的预处理
            2.1.2 总RNA的提取
            2.1.3 DNase消化
            2.1.4 总RNA的浓度测定和质量检测
        2.2 cDNA合成
        2.3 青虾几丁质酶基因中间片段的获得及验证
            2.3.1 中间片段的获取
            2.3.2 中间片段的验证
        2.4 RACE快速扩增
            2.4.1 青虾六个几丁质酶基因3’端扩增
            2.4.2 青虾六个几丁质酶基因的5’端扩增
        2.5 PCR产物的克隆
            2.5.1 PCR产物的回收
            2.5.2 连接
            2.5.3 连接产物转化感受态细胞
            2.5.4 重组克隆的鉴定
            2.5.5 质粒提取与测序
        2.6 序列拼接
        2.7 青虾六个几丁质酶基因全长cDNA完整性验证
        2.8 生物信息学分析
    3 结果与分析
        3.1 青虾六个几丁质酶基因中间片段序列
        3.2 青虾六个几丁质酶基因3’端的分离
        3.3 青虾六个几丁质酶基因5’端的分离
        3.4 青虾六个几丁质酶基因全长cDNA序列结构特征
        3.5 基因命名和系统进化分析
        3.6 青虾六个几丁质酶基因编码的氨基酸序列比对
        3.7 三级结构预测
        3.8 青虾六个几丁质酶氨基酸序列一致性比较
    4 讨论
第三章 青虾六个几丁质酶基因的时空表达特征以及温度变化对表达的影响
    1 实验材料
        1.1 实验虾
        1.2 主要试剂
        1.3 仪器
    2 实验方法
        2.1 青虾胚后发育样品的采集
        2.2 青虾组织表达样品的采集
        2.3 青虾蜕壳周期样品的采集
        2.4 不同温度样品的采集
        2.5 青虾六个几丁质酶基因时空表达的实时荧光定量PCR分析
            2.5.1 引物设计及检验
            2.5.2 总RNA的提取
            2.5.3 cDNA第一链的合成
            2.5.4 实时荧光定量PCR反应
            2.5.5 实时荧光定量PCR分析
    3 结果
        3.1 青虾各样本总RNA的检测
        3.2 荧光定量引物的验证
        3.3 青虾六个几丁质酶基因在成体不同组织中的表达
        3.4 青虾六个几丁质酶基因在胚后发育期的表达
        3.5 青虾六个几丁质酶基因在蜕壳周期的表达
        3.6 青虾六个几丁质酶基因在不同温度下的表达
    4 讨论
        4.1 青虾六个几丁质酶基因在成体不同组织的表达差异
        4.2 青虾六个几丁质酶基因在不同发育时期的表达差异
        4.3 青虾六个几丁质酶基因在蜕壳周期和温度下的表达规律
全文结论
参考文献
附录
致谢
已发表或已接收的论文


【参考文献】：
期刊论文
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[2]二硫键与蛋白质的结构[J]. 徐国恒.  生物学通报. 2010(05)
[3]几种重金属离子对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响[J]. 黄小红,陈宏惠,刘建昌,金艳冬,肖其韬.  水生生物学报. 2008(06)
[4]甲壳动物幼体消化酶研究进展[J]. 潘鲁青,刘泓宇,肖国强.  中国水产科学. 2006(03)
[5]金属离子对凡纳对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响[J]. 林建城,王悦,谢晓兰,龚敏,陈清西.  台湾海峡. 2005(01)
[6]淡化方式与盐度对凡纳对虾幼虾生长的影响[J]. 臧维玲,林喜臣,戴习林,姚庆祯,江敏,罗春芳,徐桂荣,丁福江.  上海水产大学学报. 2003(04)
[7]中华绒螯蟹幼体消化道甲壳质消化细菌的研究[J]. 薛俊增,吴惠仙.  应用生态学报. 2003(05)
[8]影响日本对虾亲虾蜕壳因素的探讨[J]. 黄加祺,林琼武.  海洋科学. 2003(02)
[9]四种虾蟹类幼体消化酶活力的比较研究[J]. 潘鲁青.  青岛海洋大学学报. 1997(03)
[10]盐度对罗氏沼虾幼虾生长的影响[J]. 徐桂荣,朱正国,臧维玲,戴习林,江敏,于万玲,王为东.  上海水产大学学报. 1997(02)



本文编号：3636078