三角帆蚌Toll-样受体的鉴定及其免疫功能研究

发布时间：2022-12-10 00:38

　　三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国重要的淡水养殖经济贝类之一,近年来,由于疾病频发导致的大规模死亡事件,影响我国贝类养殖业的持续发展,造成了巨大的经济损失。Toll-样受体在识别以及清除病原微生物中起重要作用,对TLR信号通路的研究有助于我们更好地了解三角帆蚌抗菌免疫机制,为贝类的健康养殖提供理论基础。搜索三角帆蚌转录组数据库得到TLR的EST序列并设计引物,运用RACE-PCR方法获得3种Toll-样受体（以下分别简称HcTol18,9,10）的cDNA全长。结果显示:HcToll8,9,10的cDNA全长分别为2538 bp;3692 bp和2612 bp,含有2139 bp,2157 bp和2355 bp的ORF,分别预测编码712,719和784个氨基酸。生物信息学分析显示,HcTo118,9,10的蛋白质都包含一个N端信号肽,保守的结构域LRRs和TIR及一段螺旋结构的跨膜域。多序列比对表明HcToll8,9分别与虾夷扇贝（M.yessoensis）,海湾扇贝（A.irradians）的同源性最高,分别为31.38%和32.65%,HcToll 10与长牡... 

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第1章 综述
    1.1 引言
    1.2 贝类防御机制概述
        1.2.1 贝类免疫的模式识别机制
        1.2.2 病原相关分子模式(PAMP)
        1.2.3 模式识别受体(PRR)
    1.3 Toll-样受体的研究进展
        1.3.1 TLRs的发现
        1.3.2 TLRs的分子结构
        1.3.3 TLRs的细胞定位
    1.4 TLRs的模式识别作用
        1.4.1 对细菌的识别
        1.4.2 对病毒核酸的识别
        1.4.3 对真菌多糖成分的识别
        1.4.4 对原生动物和寄生虫的识别
        1.4.5 识别损伤相关或危险相关模式分子
    1.5 TLR介导的天然免疫信号通路
    1.6 水生动物TLR研究进展
    1.7 本研究目的及意义
第2章 三角帆蚌Toll-样受体的鉴定及其免疫功能
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 实验菌株、载体及细胞
        2.2.3 实验试剂
        2.2.4 实验仪器
        2.2.5 实验用引物信息
    2.3 实验方法
        2.3.1 三角帆蚌总RNA的提取
        2.3.2 三角帆蚌cDNA的合成
        2.3.3 HcTLRs基因中间序列
        2.3.4 HcTLRs cDNA序列全长
        2.3.5 HcTLRs基因序列分析
        2.3.6 HcTLRs在蚌组织中的特异性表达
        2.3.7 蚌的刺激试验
        2.3.8 荧光实时定量PCR
        2.3.9 HcTLRs的原核表达及重组蛋白纯化
        2.3.10 HcToll9多克隆抗体的制备及纯化
        2.3.11 HcToll9多克隆抗体的检测
        2.3.12 检测HcToll9在各组织中的表达
        2.3.13 微生物结合实验
        2.3.14 酶联免疫吸附试验
        2.3.15 血细胞mRNA原位杂交
        2.3.16 真核表达载体的构建
        2.3.17 亚细胞定位
        2.3.18 荧光素酶双报告基因试验
    2.4 实验结果
        2.4.1 提取总RNA
        2.4.2 HcToll8,9,10基因全长的克隆
        2.4.3 TLRs基因cDNA全长及推导的氨基酸序列
        2.4.4 氨基酸序列的同源性比对
        2.4.5 系统进化树分析
        2.4.6 HcTLRs基因的组织表达
        2.4.7 PAMP刺激三角帆蚌后TLRs的表达模式
        2.4.8 HcToll9和HcToll10原核表达和纯化
        2.4.9 多克隆抗体及ELISA检测
        2.4.10 HcToll9蛋白在蚌组织中的分布
        2.4.11 rHcToll-9,10-LRR与微生物的结合
        2.4.12 rHcToll-9,10-LRR与PAMP的结合
        2.4.13 血细胞mRNA原位杂交
        2.4.14 重组蛋白亚细胞定位
        2.4.15 荧光素酶双报告基因实验
    2.5 讨论
第3章 结论与展望
    3.1 结论
    3.2 展望
致谢
参考文献


【参考文献】：
期刊论文
[1]我国贝类养殖管理现状及建议[J]. 王靖陶,慕永通.  中国渔业经济. 2010(03)
[2]我国养殖贝类大规模死亡的原因分析及防治对策[J]. 张国范,李霞,薛真福.  中国水产. 1999(09)

博士论文
[1]TLR4在创伤性脑损伤急性炎症损伤中的作用机制及姜黄素的保护效应研究[D]. 朱海涛.第三军医大学 2016



本文编号：3715695