甲状腺素受体介导甲状腺素调控牙鲆变态的研究
发布时间：2023-05-07 05:39
甲状腺素(thyroid hormone,TH)是一类氨基酸衍生物,在个体发育、维持内环境稳定、细胞增殖和分化等方面均有广泛的作用。牙鲆(Paralichthys olivaceus)在我国是一种重要的海洋经济养殖鱼类,其从仔鱼到稚鱼的转变中经历一个剧烈的变态发育过程,伴随着身体对称性的失去和眼睛的移位等等,该过程受甲状腺素的调控。业已证实,甲状腺素通过甲状腺素受体(thyroid hormone receptor,TR)诱导加速牙鲆仔鱼的变态。但到目前为止,关于甲状腺素调控仔鱼变态的机制知之甚少。本文从三个方面展开研究,主要结果如下:1、牙鲆变态过程中甲状腺素受体和脱碘酶表达的关系为研究外源性TH对牙鲆变态期间脱碘酶和甲状腺素受体的影响,笔者将15 dph(15 days post hatch,出膜后15天)的仔鱼随机分成3组:正常对照组(normal control,NC)、TH处理组和TU(thiourea,硫脲)处理组,饲养直至41 dph。为了评估用TU处理的牙鲆是否可以通过外源性TH来拯救其变态,笔者在35 dph(NC组牙鲆已经完成变态)时设计了拯救实验,将TU组的幼体分...
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要中英文缩略词表
第一章 引言
1 甲状腺素
1.1 甲状腺素的发现
1.2 甲状腺素的合成和分泌
1.3 甲状腺素的生理作用
1.4 甲状腺素的作用机制和甲状腺素受体的发现
2 甲状腺素受体
2.1 甲状腺素受体的结构和分类
2.2 甲状腺素受体在组织和细胞中的分布
2.3 甲状腺素受体的生理功能
2.3.1 TR的基因受体作用
2.3.2 TR的非基因受体作用
2.4 甲状腺素受体的共作用因子
3 甲状腺素和甲状腺素受体在鱼类早期发育中的作用
4 研究目的和意义
第二章 牙鲆变态过程中甲状腺素受体与脱碘酶表达的关系
1 材料与方法
1.1 动物实验和取样
1.2 试验试剂
1.3 试剂的配制
1.4 主要试验器材
1.5 试验方法
1.5.1 总RNA的提取
1.5.2 反转录制备cDNA
1.5.3 引物设计
1.5.4 荧光定量PCR
1.5.5 四碘甲状腺原氨酸T4和三碘甲状腺原氨酸T3的酶联免疫吸附试验
2 试验结果
2.1 总RNA的提取和鉴定
2.2 牙鲆变态发育过程中脱碘酶在体内的表达
2.3 牙鲆变态发育过程中体内甲状腺素受体的表达
2.4 变态期间牙鲆体内T4和T3整体水平的变化
2.5 外源TH处理及其对牙鲆脱碘酶和甲状腺素受体表达的影响
2.6 TU处理组牙鲆的变态拯救
3 讨论
3.1 脱碘酶和甲状腺素受体在牙鲆变态过程中的表达
3.2 外源TH和TU处理对牙鲆变态过程中脱碘酶和甲状腺素受体表达水平的影响
3.3 变态拯救
第三章 甲状腺素受体结合蛋白的鉴定及其受甲状腺素调控的变化
1 材料与方法
1.1 试验试剂
1.2 试验主要器材
1.3 试验方法
1.3.1 细胞培养
1.3.2 牙鲆TRβ多克隆抗体的制备
1.3.3 TRβ在牙鲆胚胎细胞中的过表达
1.3.3.1 TRβmRNA编码区(CDS)全序列的扩增
1.3.3.2 双酶切
1.3.3.3 连接及转化
1.3.3.4 重组质粒的鉴定和扩增抽提
1.3.3.5 pEGFP-N1-TRβ转染细胞
1.3.3.6 RT-qPCR及WesternBlot检测转染细胞中TRβ的表达
1.3.4 免疫沉淀
1.3.5 WesternBlot检测IP复合物
1.3.6 质谱检测IP复合物
1.3.7 RT-qPCR分析TRβ候选相互作用蛋白的mRNA在牙鲆变态过程中的表达及其对外源激素处理的反应
2 试验结果
2.1 牙鲆TRβ多克隆抗体的制备
2.1.1 TRβ多克隆抗体的质量检验
2.1.2 TRβ多克隆抗体用于牙鲆组织蛋白和胚胎细胞蛋白的WesternBlot分析
2.2 TRβ在牙鲆胚胎细胞中的过表达
2.2.1 牙鲆TRβ真核表达载体的构建
2.2.2 pEGFP-N1-TRβ重组质粒转染牙鲆胚胎细胞
2.2.3 实时荧光定量PCR和WesternBlot检测转染牙鲆胚胎细胞中TRβ的表达
2.3 免疫沉淀
2.3.1 WesternBlot检测免疫沉淀复合物
2.3.2 液质联用质谱法检测IP复合物
2.3.3 可信蛋白在牙鲆变态过程中的表达及其对外源激素刺激的反应
3 讨论
第四章 牙鲆变态过程中蛋白质组受外源性甲状腺素影响的变化
1 材料与方法
1.1 动物试验和采样
1.2 试验试剂
1.3 试验试剂的配制
1.4 试验主要器材
1.5 试验方法
1.5.1 制备蛋白质样品并用TMT试剂标记
1.5.2 肽段混合物的高效液相色谱分离
1.5.3 LC-MS/MS在线分析肽段混合物
1.5.4 数据处理和分析
1.5.5 实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹
1.5.6 生物信息学分析
2 试验结果
2.1 试验鱼的生长状态
2.2 通过TMT定量分析鉴定的TH处理和自然发育的牙鲆之间差异表达的蛋白
2.3 差异表达蛋白的亚细胞定位
2.4 通过定量实时PCR和Western印迹验证差异表达的蛋白质
2.5 通过GO和KEGG通路富集分析评估差异表达的蛋白质
2.6 蛋白互作分析
3 讨论
总结和展望
参考文献
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
本文编号：3810387
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要中英文缩略词表
第一章 引言
1 甲状腺素
1.1 甲状腺素的发现
1.2 甲状腺素的合成和分泌
1.3 甲状腺素的生理作用
1.4 甲状腺素的作用机制和甲状腺素受体的发现
2 甲状腺素受体
2.1 甲状腺素受体的结构和分类
2.2 甲状腺素受体在组织和细胞中的分布
2.3 甲状腺素受体的生理功能
2.3.1 TR的基因受体作用
2.3.2 TR的非基因受体作用
2.4 甲状腺素受体的共作用因子
3 甲状腺素和甲状腺素受体在鱼类早期发育中的作用
4 研究目的和意义
第二章 牙鲆变态过程中甲状腺素受体与脱碘酶表达的关系
1 材料与方法
1.1 动物实验和取样
1.2 试验试剂
1.3 试剂的配制
1.4 主要试验器材
1.5 试验方法
1.5.1 总RNA的提取
1.5.2 反转录制备cDNA
1.5.3 引物设计
1.5.4 荧光定量PCR
1.5.5 四碘甲状腺原氨酸T4和三碘甲状腺原氨酸T3的酶联免疫吸附试验
2 试验结果
2.1 总RNA的提取和鉴定
2.2 牙鲆变态发育过程中脱碘酶在体内的表达
2.3 牙鲆变态发育过程中体内甲状腺素受体的表达
2.4 变态期间牙鲆体内T4和T3整体水平的变化
2.5 外源TH处理及其对牙鲆脱碘酶和甲状腺素受体表达的影响
2.6 TU处理组牙鲆的变态拯救
3 讨论
3.1 脱碘酶和甲状腺素受体在牙鲆变态过程中的表达
3.2 外源TH和TU处理对牙鲆变态过程中脱碘酶和甲状腺素受体表达水平的影响
3.3 变态拯救
第三章 甲状腺素受体结合蛋白的鉴定及其受甲状腺素调控的变化
1 材料与方法
1.1 试验试剂
1.2 试验主要器材
1.3 试验方法
1.3.1 细胞培养
1.3.2 牙鲆TRβ多克隆抗体的制备
1.3.3 TRβ在牙鲆胚胎细胞中的过表达
1.3.3.1 TRβmRNA编码区(CDS)全序列的扩增
1.3.3.2 双酶切
1.3.3.3 连接及转化
1.3.3.4 重组质粒的鉴定和扩增抽提
1.3.3.5 pEGFP-N1-TRβ转染细胞
1.3.3.6 RT-qPCR及WesternBlot检测转染细胞中TRβ的表达
1.3.4 免疫沉淀
1.3.5 WesternBlot检测IP复合物
1.3.6 质谱检测IP复合物
1.3.7 RT-qPCR分析TRβ候选相互作用蛋白的mRNA在牙鲆变态过程中的表达及其对外源激素处理的反应
2 试验结果
2.1 牙鲆TRβ多克隆抗体的制备
2.1.1 TRβ多克隆抗体的质量检验
2.1.2 TRβ多克隆抗体用于牙鲆组织蛋白和胚胎细胞蛋白的WesternBlot分析
2.2 TRβ在牙鲆胚胎细胞中的过表达
2.2.1 牙鲆TRβ真核表达载体的构建
2.2.2 pEGFP-N1-TRβ重组质粒转染牙鲆胚胎细胞
2.2.3 实时荧光定量PCR和WesternBlot检测转染牙鲆胚胎细胞中TRβ的表达
2.3 免疫沉淀
2.3.1 WesternBlot检测免疫沉淀复合物
2.3.2 液质联用质谱法检测IP复合物
2.3.3 可信蛋白在牙鲆变态过程中的表达及其对外源激素刺激的反应
3 讨论
第四章 牙鲆变态过程中蛋白质组受外源性甲状腺素影响的变化
1 材料与方法
1.1 动物试验和采样
1.2 试验试剂
1.3 试验试剂的配制
1.4 试验主要器材
1.5 试验方法
1.5.1 制备蛋白质样品并用TMT试剂标记
1.5.2 肽段混合物的高效液相色谱分离
1.5.3 LC-MS/MS在线分析肽段混合物
1.5.4 数据处理和分析
1.5.5 实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹
1.5.6 生物信息学分析
2 试验结果
2.1 试验鱼的生长状态
2.2 通过TMT定量分析鉴定的TH处理和自然发育的牙鲆之间差异表达的蛋白
2.3 差异表达蛋白的亚细胞定位
2.4 通过定量实时PCR和Western印迹验证差异表达的蛋白质
2.5 通过GO和KEGG通路富集分析评估差异表达的蛋白质
2.6 蛋白互作分析
3 讨论
总结和展望
参考文献
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
本文编号：3810387
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