独脚金内酯（SLs）调节黄瓜叶片衰老和相关基因克隆及功能分析

发布时间：2020-06-24 22:02

【摘要】：黄瓜(Cucumis sativus L.)葫芦科黄瓜属植物,广泛种植于温带和热带地区,是我国的重要蔬菜作物之一,因其丰富的营养价值深受人们喜爱。在农业生产上黄瓜的产量和品质就尤为重要,叶片衰老提前出现将导致其产量和品质下降。叶片早衰严重影响黄瓜的光合作用进程,有机物积累能力下降,强制缩短植株发育周期,加大了营养消耗,进而限制了黄瓜产量和品质,因此延缓植物衰老,为黄瓜在生产中保产保质提供新思路。独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是植物内源信号因子,具有抑制植物分枝、调节叶片衰老,诱导根寄生性种子萌发、调节丛枝菌根共生与根部网络结构、缓解非生物胁迫的伤害等多种生物学功能。本实验通过外源施加SLs类似物GR24处理使黄瓜叶片出现早衰表型以及对SLs生物合成关键基因CsCCD7、CsCCD8的功能研究,为进一步研究SLs调节叶片衰老的分子机制提供参考。本实验具体结果如下:(1)成功克隆黄瓜SLs生物合成关键基因CsCCD7、CsCCD8编码区全长分别为1801bp和1621bp,编码614和545个氨基酸,经生物信息学分析得出,两基因均属于CCDs基因家族;揭示了CsCCD7、CsCCD8及其编码蛋白的特性,二级结构结果表明两种蛋白均含有大量延伸链结构和无规则卷曲;三级结构结果表明,CsCCD7蛋白与己知蛋白质RPE65的三级结构有较高的同源性;同源性分析和系统进化分析显示,CsCCD7、CsCCD8均与同为葫芦科植物甜瓜的CmCCD7、CmCCD8同源性最高;基因启动子顺势作用元件的分析显示,CsCCD7、CsCCD8基因与脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸等多种激素调节通路相关和光相关顺势作用元件联系密切。(2)外源GR24处理可以加速黑暗下离体黄瓜叶片衰老的进程,亚显微结构观察显示,GR24蘸根处理后移至育苗基质10d的叶片中叶绿体基粒片层开始出现断裂分散,在15d时叶绿体基粒片层结构受损解体,基粒数量减少。同时测定相关衰老生理指标显示叶绿素含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm、净光合速率都相对于对照组显著下降,导致光合能力减弱,衰老提前。其中1μM处理效果最为显著,故选定为最终的处理浓度,进行后续实验。(3)经1μMGR24蘸根处理48h后的黄瓜的根、第5叶中CsCCD7、CsCCD8基因的表达量相对于对照组显著上调,其中根部CsCCD7基因最早响应GR24,在处理3h时CsCCD7基因表达量相对于对照组显著上调,而根部CsCCD8和第5叶CsCCD7、CsCCD8基因的表达量在处理24h时才显著高于对照组,说明外源GR24处理可能促使黄瓜内源性SLs含量升高;同时测定GR24处理的黄瓜第五叶片中的衰老相关基因(SGR1、CsPAO、CsPPH)的表达量,结果发现表达量均显著上调,其中CsPAO和CsPPH在GR24处理3h时基因表达量显著上调,应答速度高于叶片中SGR1的表达情况,说明GR24处理可能导致叶绿素加速降解,叶片衰老提前出现。(4)黄瓜CsCCD7、CsCCD8基因在侧根、主根、茎、顶芽、新叶、成熟叶、节间和叶腋处各器官中均有表达,其中侧根和主根的表达量最大且显著高于其他器官,同时叶腋处、顶芽和成熟叶也有较高的表达量水平。经蘸根处理48h后移至土培的黄瓜各组织中CsCCD7、CsCCD8基因表达量基本随时间的推移稳步升高,说明GR24处理对黄瓜中各组织的CsCCD7、CsCCD8基因表达量并非瞬时应答,而是出现持续升高变化。(5)成功构建了CsCCD7、CsCCD8基因的过表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化方式将其转化野生型拟南芥,获得了两基因过表达拟南芥5个阳性株系。经过PCR鉴定和表达量鉴定,转基因结果可靠。CsCCD7、CsCCD8转基因拟南芥在出芽后20、32天时相对于对照组WT提早进入生殖生长阶段,部分叶片并出现黄化表现,其中CsCCD7转基因植株衰老程度最大。说明过表达CsCCD7、CsCCD8基因可以使拟南芥加速衰老。
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S642.2
【图文】：

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图 1-1 叶片衰老的影响因素示意图[32]Fig.1-1 Schematic diagram of the influencing factors of leaf senescence[32]1.1.3.1 叶片年龄和生长发育因素叶片衰老主要依赖年龄发育，在非逆境条件下，叶片发生自然衰老。Jibran[33]等人根据模式植物拟南芥叶片衰老的研究结果整合总结出一个模型来解释叶片衰老的问题。认为叶片发育过程中要经历幼叶，成熟叶，衰老叶三个阶段，在幼

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哈尔滨师范大学毕业论文叶时期对衰老诱导信号（环境因素和激素因素）不敏感，不能诱导叶片出现衰老表征。研究表明，茉莉酸甲酯[33]和乙烯[34]分别处理植物的幼叶和成熟叶，发现成熟叶比幼叶响应机制更敏感、衰老的速度更快。将这些变化称为年龄相关变化（Age-related-changes,ARCs），并定义为严格依赖于年龄和发育的不可逆转的变化，衰老信号可以量化被看作是积累的，与叶片衰老程度呈正相关，而不是一时产生的，受激素和基因的共同控制。根据模型验证了即使是对植物有利的环境条件，也会发生自然衰老的变化（图 1-2）。1.1.3.2 植物激素途径参与叶片衰老植物激素对叶片衰老的调控是一个复杂的过程，叶片衰老与许多激素的信号通路都有密切联系，不同激素之间也存在拮抗和协同作用，贯穿整个衰老进程的始末[33.35]。激素在叶片衰老中起关键作用一直是被人们公认的，参与叶片衰老调控的激素主要有促进衰老的乙烯、水杨酸、茉莉酸、脱落酸、独脚金内酯等，以及抑制衰老的细胞分裂素。

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