基于微滴式数字PCR的有机磷农药多残留生物条形码免疫分析方法研究

发布时间：2020-05-09 09:33

【摘要】：农产品质量安全问题关乎国民健康和社会稳定。农药的不合理使用对环境甚至是人类健康造成很大威胁,为了满足农药残留标准的要求,需要建立一种高灵敏度、高准确性的检测方法。生物条形码免疫分析方法依据抗体识别抗原,基于胶体金和核苷酸链信号放大技术、磁性纳米粒子分离技术的特性来实现对农药的检测。微滴式数字PCR(ddPCR)作为一种绝对定量检测技术被广泛应用于医学、转基因检测、微生物检测等领域,还没有关于ddPCR检测农药的报道,本研究将免疫竞争反应解离下来的生物条形码DNA链在ddPCR上进行定量检测。主要研究内容与结果为:制备胶体金纳米探针和磁性纳米探针,设计了一组特异性很高的PCR扩增所需的DNA模板、上下游引物和探针,并优化了PCR扩增时的退火温度,上下游引物浓度和探针浓度。对胶体金纳米探针和磁性纳米探针的工作浓度、甲醇含量进行了优化。在最优条件下建立标曲,其三唑磷的检出限(IC_(10))分别为0.002 ng mL~( 1),IC_(50)的值为0.197 ng mL~( 1)。线性检测范围为0.01-20 ng mL~( 1)。对苹果、黄瓜、卷心菜和大米四种基质进行了添加回收实验。该方法的平均回收率在76.9-94.4%之间,相对标准偏差(RSD)在10.8-19.9%之间。该方法在苹果、黄瓜、卷心菜和大米四种样品基质中的回收浓度与LC-MS/MS在四种样品基质的回收浓度做相关性实验,发现线性良好,也证明了基于ddPCR的生物条形码免疫分析方法的可靠性,可以用于农产品中三唑磷农药残留的限量检测。建立了基于ddPCR的生物条形码免疫分析方法同时检测三唑磷,对硫磷和毒死蜱三种农药,本章设计了另外两组DNA链、上下游引物和探针。优化了这两组序列PCR扩增的退火温度、上下游引物和探针浓度。优化了需要加入对硫磷和毒死蜱抗体的含量和DNA的含量。做了关于三种抗体之间特异性的实验,发现特异性较好。对抗原和抗体的工作浓度进行了优化。在最优条件下建立标曲,其三唑磷、对硫磷和毒死蜱的检出限(IC_(10))分别为0.22 ng mL~(-1),0.45 ng mL~(-1)和4.49 ng mL~(-1)。对苹果、黄瓜、卷心菜和梨基质进行了添加回收实验。该方法的平均回收率在75.5 98.9%之间,RSD在8.3 16.7%之间。该方法在梨中的回收浓度与LC-MS/MS在梨基质的回收浓度做相关性实验,发现线性良好,证明了基于ddPCR的生物条形码免疫分析方法的准确可靠性。本研究建立的基于微滴式数字PCR的生物条形码免疫分析方法能够同时检测三唑磷、对硫磷和毒死蜱。也为实现高通量的检测更多种农药奠定了基础。
【图文】：

数字,基本原理

图 1.2 数字 PCR 的基本原理Fig. 1.2 Principles of digita PCR原则，为数字 PCR 的发展奠定了基础gm 公司生产的芯片 dPCR（chip digital ital PCR, ddPCR)和2016年Stilla公司生原理主要是一个样本被无限的稀释，每一个单元里，有一个，多个或者没后再对每个单元格内的阳性和阴性信

序列,脱氧核酶,脱氧核糖,检测系统

图 1.5 脱氧核酶脱氧核糖检测系统Fig. 1.5 Detection system of DNAzyme biosensor基因的检测因是现在很敏感的词汇，科学家尚未证明转基因带来的具体危害，，但是也不和生态系统就是安全无害的，因此对于转基因含量实施监测至关重要(Gao e et al., 2016)。Giraldo 等在文献中用 ddPCR 对转基因植物进行检测和定量，要求。通过内参基因判断转基因是否插入目标基因中，比如说当样品是非转至 11 个微滴，而转基因样品显示 161 至 1223 个阳性微滴。qPCR 也可以应因事件。但是 ddPCR 是一种更准确、灵明度更高的方法。因此 ddPCR 对于可追溯性要求的基于牧场的生物技术应用提供了指导和资源(Giraldo et al., 20 PCR，qPCR 和 ddPCR 来检测加工食品中的转基因水稻品系 TT51-1，在普通油炸或微波样品中几乎检测不到相对较长的靶标序列。qPCR 在煮沸，干燥中能检测到扩增荧光信号，但在油炸样品中几乎观察不到。发现食品加工直检测。ddPCR 由于其稳定性好和准确性高，对 PCR 反应抑制剂的耐受能力原料而成为加工食品中转基因成分检测的更受欢迎的方法(Wang et al., 2019)。字 PCR 还应用于产前诊断（Lee et al., 2015; Camunas-Soler et al., 2018)，癌症分
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS207.53

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