停流型二维液相色谱系统的构建及其在食源性蛋白水解物分离及活性在线检测中的应用

发布时间：2020-05-19 07:48

【摘要】：食源性生物活性肽具有安全性高、易吸收、来源广等多种优点,越来越受到科研学者的关注。然而,受传统分离纯化技术效率限制,目前已报道的生物活性肽段序列很少,因此,发展一种可同时实现食源性蛋白水解物快速分离、活性肽段检测和结构鉴定的技术手段是目前亟需解决的问题。本文分别探讨了肽分子在停流型二维液相色谱(2D-LC)中第一维凝胶色谱(SEC)和反相色谱(RPLC)的额外峰展宽情况,并对现有二维色谱峰检测方法进行了一系列改善,在此基础上,构建了快速停流型SEC×RPLC-MS系统用于改善食源性蛋白水解物中肽段的分离和鉴定,与此同时,本文进一步构建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系统,用于食源性蛋白水解物中活性肽段的快速检测和鉴定。本文主要研究内容和结果如下:(1)构建了一种常规全自动停流型SEC×RPLC二维液相色谱,并系统研究了停流操作对停流型2D-LC中第一维SEC分离的影响,结果表明:大分子蛋白质或多肽在第一维SEC停流分析过程中的额外峰展宽极小,而小分子肽的额外峰展宽相对较大,但可通过调整其停流时间和分析温度对其进行控制,此外,停流位置和停流次数对样品在第一维SEC中的额外峰展宽影响极小。将该停流型SEC×RPLC应用于花生蛋白水解物的分离,获得了明显优于单维液相色谱的分离效果,其全二维分离峰容量高达504。(2)在停流型SEC×RPLC的基础上,将两个维度的色谱柱互换并对阀切换结构进行改良,进一步构建了一种可用于蛋白水解物分子量分析的常规停流型RPLC×SEC二维液相色谱,并系统性研究了第一维RPLC的额外峰展宽情况,结果表明:分子量较大或保留时间较长的物质在第一维RPLC中额外峰展宽均较小,仅有保留时间较短的小分子物质存在较为严重的额外峰展宽。将该停流型RPLC×SEC用于食源性蛋白水解物的分离分析,发现第一维RPLC分离可大大降低第二维SEC的分离难度,改善其分离效果。与停流型SEC×RPLC相比,停流型RPLC×SEC的全二维分离速度较慢且峰容量较低(仅为200左右),但该系统可用于测定第一维RPLC全流出组分的分子量分布情况,同时,还可用于更准确地测定第一维RPLC特定流出组分的分子量。(3)基于原两步检测法,对二维液相色谱峰检测方法进行了改良。在新方法中,引入了保留时间判定和双向峰重叠判定,其中保留时间判定可根据第一维流出组分的不同采取不同的色谱峰偏移阈值,以适用于采用可变第二维液相色谱梯度的二维液相色谱峰检测,而双向峰重叠可支持设定峰宽对比高度,以减小峰拖尾对二维液相色谱峰检测的影响。新方法在常规分离、第一维欠采样和第二维采用可变梯度时所获得的复杂二维液相色谱数据中均获得了较好的检测效果,正确检测率均高于60%。与原Peters方法相比,新方法所得二维色谱峰检测的正确率至少提高了6%。(4)对常规停流型SEC×RPLC的第二维液相色谱(~2D-LC)进行升级,构建了一种基于常规离子源的快速停流型SEC×RPLC-MS系统,并对其分离条件进行了优化,应用于食源性蛋白水解物的肽组学分析。结果表明:超高效UPLC SEC与HSS T3柱可作为食源性蛋白水解物二维分离的较优色谱柱对,结合进一步的进样量、组分转移体积及死体积优化,该二维色谱分离效果大大改善,峰容量高达1165,体现了其对复杂样品的强大分离能力。在玉米蛋白水解物的分离和鉴定试验中,快速停流型SEC×RPLC-MS的PSMs(母离子二级谱匹配数量)较传统1D-LC-MS提高了至少25%,MS2采集数量提高了至少两倍。将该系统进一步应用于大豆肽及酪蛋白水解物的肽段分离和鉴定,实际峰检测数量均超过200,PSMs鉴定量均超过9 k,而MS2采集量更是超过了50 k,充分展现了快速停流型SEC×RPLC-MS对食源性蛋白水解物的强大分离和鉴定能力。此外,通过将该鉴定结果与Biopep活性肽段数据库进行对比,快速地发现了酪蛋白水解物中的6条已知活性肽段,同时发现了大量包含活性片段的潜在生物活性肽段。(5)在常规停流型RPLC×SEC的基础上,对其停流型阀切换结构进行进一步的改良,并对其~2D-LC进行升级,构建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系统。通过探讨反应环管路长短、DPPH·浓度、温度及甲酸添加量对第二维SEC-DPPH自由基清除活性分析的影响,确定了第二维SEC-DPPH自由基清除活性分析的适宜条件为:反应环10 m、DPPH·浓度200μM、温度40℃、甲酸添加量0.06%。通过谷胱甘肽标准品的停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析,对该系统的有效性进行了充分验证,在此基础上,进一步将其应用于复杂混合标准品的分析,成功从复杂混标中鉴定到了具有强DPPH自由基清除活性的二肽GC和CW,并对上述两种二肽进行了验证,展示了该系统较强的创新性、有效性和实用性。
【图文】：

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图 1-1 一种二维液相色谱的样品环阀切换结构示意图-1 An advanced valve interface equipped with two sample loops comprehensive two-dimensional liquid chromatography柱接口切换接口结构与样品环结构相类似，将图 1-1 中两个样品环得到补集柱阀切换接口[75]。在二维分析过程中，，补集柱的主和再解析，相比于使用样品环，补集柱可以实现更长时间的柱具备一定的溶质浓缩效果，可使样品组分中的溶质“聚焦中的扩散，另外，补集柱的使用可同时有利于第一维组分的EC×RPLC 中的应用较多[76]。近年来随着补集柱的不断发展大，借助于补集柱的“浓缩和聚焦”作用，Wang 等人[10]利

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2D-LC 的压力波动，不利于检测器的稳定，其系统结构亦进一步改进和完善。图1-2 一种停流型二维液相色谱流路示意图Figure 1-2 Schematic presentation of a stop-flow two-dimensional liquid chromatography1.4 二维液相色谱分离效果评价为了评价 2D-LC 的分离效果，国内外科研学者发展了一系列评价方法，评价指标主要包括正交度、峰容量、实际峰检测数量等，其中正交度主要用于衡量两个维度之间液相色谱分离的独立程度[89]；峰容量用于衡量该 2D-LC 系统在该分析条件下对该样品的理论分离能力[90]；实际峰检测数量[91]用于描述该 2D-LC 对样品的实际分离情况。1.4.1 正交度2D-LC 的正交度主要用于衡量两个维度之间色谱分离的相互独立程度。为了实现更好的二维色谱分离效果，在当前 1D-LC 峰容量优化至一定程度时，我们常希望在二
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.2;O657.72

【参考文献】