鸡软骨多肽的制备分离、结构解析及其对成骨细胞生长机制影响的研究

发布时间：2020-07-11 10:40

【摘要】：鸡软骨富含胶原蛋白和硫酸软骨素,具有良好的骨健康保护功效。本文以鸡肉加工副产物鸡软骨为原料,采用不同的酶解工艺制备鸡软骨酶解物;通过特性分析和活性评价,选用最优鸡软骨酶解物进行分离纯化和结构解析,获得有明确氨基酸序列的小肽;考察鸡软骨活性肽对MC3T3-E1增殖、分化和凋亡的影响,并研究其逆转MC3T3-E1细胞凋亡损伤的作用机制。本实验采用单因素优化实验考察不同蛋白酶、酶底比、pH、温度和时间对鸡软骨粉末酶解的影响。结果表明,采用0.50%碱性蛋白酶、pH7.0、55°C和9 h进行酶解可获得最优鸡软骨酶解物,其蛋白质回收率为57.00%,水解度为26.53%,小分子肽(1kDa)占比为61.62%,DPPH·清除IC50值为5.14 mg/mL,ORAC值为0.57μmol TE/mg peptides。皮尔逊相关性分析结果表明,酶解物的水解度和分子量分布(1 kDa)分别与其ORAC活性具有显著的相关性,相关系数r分别为0.737和0.534。采用DEAE-52阴离子交换色谱法和凝胶排阻色谱法对最优鸡软骨酶解物进行分离纯化,最终获得具有最高ORAC活性的F1-c组分(3.23μmol TE/mg peptides)。通过UPLC-ESI-MS/MS法分析,首次鉴定得到五条鸡软骨多肽:GGAP、QIGPA、QLGPA、MPKYA和QGPAN。采用MTT法和EdU法检测各多肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响,结果表明0.1 mM的多肽QIGPA、QLGPA、MPKYA和QGPAN孵育细胞48 h后,细胞存活率分别提高39.34%、21.44%、21.23%和37.06%。其中,QIGPA多肽能够显著促进细胞DNA的合成(p0.05),EdU阳性细胞的占比高达16.89%。MC3T3-E1细胞的分化程度随着培养时间的延长而提高,鸡软骨多肽(0.1 mM)与分化培养基共同作用3d对该细胞碱性磷酸酶活性无显著影响(p0.05)。相反,多肽作用7d均能显著提高细胞的碱性磷酸酶水平,且当分化时间延长至14d时,多肽QIGPA、MPKYA和QGPAN共同处理下细胞中NBT-甲瓒的平均光密度值均显著高于分化对照组(p0.05),且均高于0.61。其中,多肽QIGPA与QGPAN的碱性磷酸酶活性分别高达为200.03和276.56 nmol/min/mg protein。结果表明,鸡软骨多肽QIGPA、MPKYA和QGPAN具有促进MC3T3-E1细胞分化的能力。采用3.2μM的Cd(Ac)_2孵育MC3T3-E1细胞48 h构建镉诱导的成骨细胞凋亡模型,并评价鸡软骨多肽(0.5 mM)的保护作用。CCK-8结果表明,多肽GGAP、QIGPA、QLGPA和QGPAN作用后细胞活率较模型组分别提高21.03%、38.54%、42.71%和13.69%。Annexin V-FITC/PI法实验结果显示这四条多肽处理后早期凋亡细胞占比分别为13.96%、25.48%、13.04%和8.20%,而对应的晚期凋亡和坏死细胞分别占14.01%、8.40%、3.16%和12.04%,能够显著逆转成骨细胞凋亡损伤(p0.05)。其中,多肽QIGPA和QGPAN作用后其JC-1红绿平均荧光强度的比值较模型组分别增加15.71%和25.95%,揭示其能够显著逆转成骨细胞凋亡损伤模型的线粒体膜电位的下降(p0.05)。除MPKYA多肽,其余四条鸡软骨多肽均能够通过抑制镉诱导的p-38与ERK1/2蛋白的磷酸化,从而降低成骨细胞的凋亡损伤。综上所述,从鸡软骨鉴定所得的QIGPA、MPKYA和QGPAN多肽能促进成骨细胞的增殖和分化;而多肽GGAP、QIGPA、QLGPA和QGPAN能够逆转成骨细胞凋亡损伤。上述结果揭示鸡软骨多肽能通过促进成骨细胞增殖分化和减缓成骨细胞凋亡损伤来而被选作潜在的骨健康保护活性成分。同时,这些多肽可作为骨健康相关功能性食品及特殊医学用途配方食品开发的原料,在保护骨健康方面具有广阔的应用前景。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS251.9
【图文】：

高分辨率CT,桡骨,骨小梁,胫骨

研究指出，关节炎患者骨量的下降不仅出现在软骨下骨中，患者的其余骨骼的骨量也出现下降[9]。而成骨细胞与机体骨细胞的生成相关，这表明，关节炎的发生会导致成骨细胞功能失调。在骨性关节炎的发生进程中，骨细胞在体外培养过程中可通过细胞间的信号传导促进软骨细胞代谢[10]。1.1.2.2 骨质疏松症研究进展骨质疏松（Ostroporosis）是一种进行性的骨退化疾病，通常伴随年龄的增长而发生[11]。它是以低骨量、骨组织退化和骨微结构破坏为特征的疾病，通常可导致骨折风险的增加[12]。其病理特征如图 1-1 所示，当骨质疏松发生时，骨质疏松组的桡骨（C）和胫骨（D）相比空白对照组（A 和 B）骨皮质变薄，骨小梁质量减少，骨小梁连接缺失，骨髓腔变大。

股骨骨折

关细胞因子进行。如图 1-2 为股骨的骨折修复过程[25]，可见骨折愈合过程包括合成和分解代谢两个阶段。最初合成代谢阶段，组织体积增加并募集血管和骨骼组织干进行分化。在临近骨折线形成软骨性愈伤组织，这个软骨组织周围的骨膜膨胀形成骨。随着软骨细胞分化，其细胞外基质发生矿化，骨折修复的合成代谢阶段终止，软骨细胞凋亡。合成代谢后是分解代谢占主导地位的延长阶段，此阶段愈伤组织体小。此阶段若软骨再吸收会发生特定合成代谢阶段，形成次生骨。当新生骨取代软，初级血管继续生成。随后，骨重塑开始，在原始骨形成第一个矿化基质被破骨细吸收，同时软骨再吸收其沉积的第二个骨也被吸收。这一延长期是成骨细胞和破骨活性的耦合周期，其中骨痂组织被重塑为骨的原始皮质结构（耦合重塑）。至此，空间重新建立。在分解代谢的最后阶段，发生了血管重构，使得血流速度恢复到损水平。可见，骨折损伤的愈合需要至少一个月的漫长周期，期间成骨细胞也参与了的愈合。

破骨细胞,成骨细胞,抗氧化剂,活性氧

活性氧和抗氧化剂对骨重塑中破骨细胞、成骨细胞和骨细胞活性的影响-3 Effect of ROS and antioxidants on the activity of osteoclasts, osteoblasts osteocytes in bone remodeling骨健康功能的物质及其研究现状生素及金属元素充是骨健康保护的一个重要途径，而来源于膳食的绿叶蔬菜、水果、给是机体维生素和金属离子的来源之一。已发现的对骨健康具有保护作用的维生素包括 VD、VB12和 VK。V素，对骨骼健康和矿物质代谢至关重要。它能够直接作用于成骨细胞响骨的形成、骨的吸收和骨量，并与非骨组织进行相互作用以维持骨[25]。在生理浓度下，活性 VD 通过 RANKL/OPG 信号通路维持

【参考文献】