乳铁蛋白与骨桥蛋白互作及其复合物的生物活性功能研究

发布时间：2020-07-13 21:22

【摘要】：乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)与骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是乳中重要的蛋白质,具有多种生物活性功能。LF与OPN具有高亲和性,可通过静电力互作发生凝聚生成复合物,其复合物的潜在功能仍未明了。母乳是婴幼儿所需的最佳营养来源,是指导配方奶粉设计参考的黄金标准。为了探索牛乳LF与OPN形成的复合物是否具有生物活性功能进而为婴幼儿提供可靠的营养来源,本研究首先在体外探究了母乳LF与OPN的互作特性以及LF-OPN复合物的消化特性来评估复合物是否可以抵御消化从而被完整吸收,并在肠道生长发育、抑菌作用、免疫调控等生物活性功能上进行了研究,为后续牛乳蛋白研究提供理论依据;随后系统地研究了牛乳LF与OPN的互作与消化特性,并且在生物活性方面聚焦了肠道生长发育功能在体外探索了牛乳LF-OPN复合物的功效及其作用机制;最后,设计了不同比例牛乳LF与OPN添加到配方奶粉,检测了配方粉在促进细胞增殖分化、抗菌免疫方面的生物活性功能,初步探究了 LF-OPN复合物用于配方奶粉中的可行性。1母乳LF-OPN复合物生物活性评估利用母乳提取的LF与OPN制备成LF-OPN复合物,在细胞增殖、分化、抑菌免疫等方面进行了评估。母乳LF与OPN在pH 3.8时聚合最为明显,并且复合物比单体更能抵御体外消化。同时,母乳复合物相较于单体显著促进人小肠腺窝状细胞(HIEC)增殖;对于Caco-2-细胞的分化具有显著促进作用;复合物与单体均具有抑菌作用(P0.05),可抑制大肠杆菌生长以及粘附Caco-2细胞的作用,其作用效果为LFLF-OPN复合物OPN,复合物的抑菌作用效果与LF更为贴近。复合物与单体均对Caco-2细胞分泌免疫因子IL-18起显著促进作用(P0.05),且作用效果介于两单体之间。2牛乳LF、OPN的互作与复合物消化特性研究研究了不同因素对牛乳LF与OPN互作的影响。首先检测pH、蛋白比例、浓度、离子作用力、温度等因素对两蛋白互作的影响。发现在pH3.8时,牛源LF与OPN发生互作最为显著,观察到凝聚现象生成胶体;LF与OPN的比例为3:1时,溶液浑浊度最大,互作最显著;蛋白浓度越高、离子作用力越小时,两蛋白发生凝聚现象越明显;复合物在4℃、37℃和60℃下呈现不同的状态,在37℃(体温)下呈现胶体状。3牛乳LF-OPN复合物对小肠上皮细胞增殖的影响及作用机制与母乳复合物相一致,牛乳LF-OPN复合物同样具有促进细胞增殖的效果,并且当牛乳蛋白与母乳蛋白形态最为相近时,即LF为铁离子游离态、OPN为钙离子饱和态,效果最为显著。研究促进增殖机制发现,LF-OPN复合物与细胞上的LF受体和OPN受体共定位,说明复合物可能与小肠上皮细胞受体相结合并进而激活相关信号通路进行调控。此外,免疫共沉淀结果显示复合物进入细胞内仍以复合状态存在。进一步的信号通路验证发现,相较两单体,复合物显著促进PI3K/Akt信号通路激活;添加化学小分子抑制剂抑制信号通路的激活则显著抑制由复合物诱导的细胞增殖,证明复合物通过PI3K/Akt信号通路调控促进细胞增殖。4不同配比LF与OPN复合物应用于婴儿配方奶粉的评估鉴于牛LF-OPN复合物具有抵御消化以及相关生物活性功能,设计添加三种不同比例的LF与OPN,体外初步评估了在婴儿配方奶粉中的效果。首先体外模拟消化评估发现,当LF与OPN比例为3:1时,抵御胃肠道的消化效果最佳;在生物活性功能方面发现当LF与OPN比例同样为3:1时,在促进细胞增殖分化、抑菌作用和促进免疫因子IL-18的分泌效果最为显著(P0.05),提示了 LF与OPN复合物用于婴儿配方奶粉的适宜比例。综上所述,本研究发现乳LF-OPN复合物具有促进生长发育、抑菌免疫等作用效果,探究了其理化方面的互作特性进而得到优化乳LF-OPN复合物的条件,揭示了复合物的生物活性功能及其作用机制。本研究结果为LF与OPN应用于改善婴儿配方奶粉提供了理论基础。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.1
【图文】：

２０１７）。其中乳活性蛋白的生物活性功能涉及到诸多方面，如促进营养物质的逡逑吸收、促进酶活反应、调控肠道微生物、促进细胞增殖、调控免疫系统、抵抗病逡逑原微生物等（Ｌ６ｎｎｅｒｄａｌ，２０１６）。乳中的活性蛋白被摄取进入机体（图１－１），经过逡逑婴幼儿胃肠道的消化释放出活性肽以及氨基酸作为营养来源，作用效果主要集中逡逑在肠道的消化以及发育过程中，但同时对整个机体水平也有着调控影响作用，例逡逑如免疫系统发育、大脑神经发育等方面，既有短期的效果，从长远看也对机体日逡逑后的生活有着深远的影响。乳活性蛋白的生物活性功能很多来自隐藏于蛋白质中逡逑的小肽。经过胃肠道的消化，乳活性蛋白被水解释放出小肽。已有诸多报道利用逡逑不同的体外模型模拟婴幼儿的消化环境以及小肽表达分析发现，人乳蛋白尤其是逡逑１３－酪蛋白产生了多种多肽（Ｙａｓｕａｋｉ和Ｂｏ，２０１５；Ｄｅｇｌａｉｒｅ等，２０１６），而人乳中的逡逑内源肽浓度在１０－２０邋ｍｇ／Ｌ之间，仅相当于总乳蛋白的０．１％邋（Ｄａｌｌａｓ等，２０１５）。逡逑蛋白质是幼体必须营养素之一

逦浙江大学博士学位论文逦逡逑Ｂｏｖｉｎｅ邋ＬＰＶＫＰＴ＾Ｇ＾ＥＩ＾ＱＩＪＷＫＹＰＤＡＶＡｒＳｆＬＫＰＤＰＳＱＫＱＴＦＬＡＰ0Ｎｇｖｇａ￡ＥＴＤＤＮＫＱＮＴＬＩ＞ｇＫａＪＥ§ＰＥＱＴＤＤＬＤＤＤＤＤＮ逦逦７８逡逑Ｈｕｍａｎ邋ＩＰＶＫＡＳＧ￡ＫＹＫＫＹＰＤＡＶＡＴＷＬＮＰＤＰＳＱＫ0ＮＬＬＡＰＡＶ：ＥＫＰＦＫＴＬｐＫＥＨＤＨＭＤＤＭＤＤＥＤＤＤＤＨＶＤ邋８２逡逑

图１－３邋０１４对蛋白质聚合的物理状态影响（１＾0８（：１＾丨５等，２0１７）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｐＨ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｃｏｍｐｌｅｘ逡逑３乳蛋白互作的研究逡逑３．邋１概述逡逑食品工业中常见的静电力复合物主要由带正电的球蛋白和带负电的多生，最初由Ｔｉｅｂａｃｋｘ报道（Ｔｉｃｂａｃｋｘ，邋１９１１）阿拉伯胶和明胶的聚合，从后续一系列研究。复合凝聚物是具有许多潜在功能特性的自组装结构，可用装生物活性化合物，以保护这些敏感成分在储存和制造期间以及在胃肠道间免受化学和物理降解，进而有效地保证其生物功效。带有相反电荷蛋白质的互作以及自组装是近些年兴起的研究话题。逡逑乳蛋白是生物聚合物，具有化学和结构上的灵活性，可用作疏水分子或的载体，它们是用于形成和稳定含有疏水性生物活性物质乳液的表面活性

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本文编号：2753994