果汁中桑葚源性成分识别及定量检测技术研究

发布时间：2020-08-12 11:11

【摘要】：随着近年来常见水果品种的普及,人们越来越喜爱如桑葚、树莓、车厘子等第三代水果。由于三代水果口感好,营养丰盛,富含具备保健功能的营养因子,所以,无论鲜食还是用于食品或保健品的开发,价格都相当昂贵。因此,其产品常会出现以假乱真、以次充好的现象,如某些桑葚加工品中不含桑葚,用廉价水果加香精来达到以假乱真的效果,这不单单欺骗了消费者,也极大地扰乱了市场秩序。运用现代生物信息学的方法和数字PCR技术,可建立快速、准确的定性、定量检测方法,为保证食品质量和维护消费者利益提供监察技术手段。本试验通过运用生物信息学的方法,利用perl语言程序下载多种常见水果基因组,并通过BLAST序列比对筛选出桑葚的特异性基因,从筛选的29262条序列经分析筛选出目标序列进行引物设计,同时根据桑葚的这段序列设计出实时荧光PCR和数字PCR的引物、探针,通过对引物和探针的特异性、引物浓度和最适反应退火温度进行了筛选和优化,建立物种特异性定性、定量检测方法,并对方法的灵敏度、检出限和加工品的适用性进行测试。(1)桑葚物种特异性常规PCR鉴定方法的建立:通过对桑葚物种特异性验证,PCR反应体系和反应程序条件的优化,以及方法灵敏度的确定,试验结果表明,本研究建立的方法物种特异性好,最适宜的退火温度为56℃,引物浓度为0.6μmol/L,在优化后的扩增条件下能够检测出质量分数为0.05%的样品(DNA,25 ng/μL),且重复性高。本方法对桑葚纯果汁、桑葚掺橙汁混合果汁、桑葚掺桃汁和苹果汁混合果汁、桑葚掺桃汁以及梨汁混合果汁样品分别进行了检测,样品中的桑葚成分均能检出。(2)桑葚物种特异性实时荧光定量PCR鉴定方法的建立:通过桑葚物种qPCR反应体系的优化,特异性和灵敏度检测,依据标准DNA溶液扩增曲线绘制了桑葚物种特异性基因的标准曲线,完成了对桑葚原性成分定量的检测。结果显示,本法具有特异性强、灵敏度高的特点,定量检出限0.006 ng/μL的桑葚基因组DNA,桑葚DNA扩增的标准曲线的方程为:y=3.529x+127.18,R2=0.995,扩增效率E%为92.032%,可以用于定量检测桑葚加工品。本方法可检测桑葚成分含0.01%的桑葚纯果汁以及可鉴定含有桑葚的混合果汁。(3)桑葚物种特异性数字PCR鉴定方法的建立:在实时荧光PCR试验筛选的引物和探针基础上,通过特异性试验、引物和探针浓度的优化、退火温度的优化以及定量线性范围和LOQ验证,确定了最佳引物和探针浓度均别为0.4μmol/L,最适宜的退火温度是57.9℃,定量检出限可达到0.006 ng/μL的桑葚基因组DNA,根据数字PCR曲线方程可计算出样品浓度,用于桑葚加工品的定量检测。综上所述,本研究基于生物信息学方法,结合定性PCR、实时荧光PCR、数字PCR技术建立了桑葚物种特异性分子生物学鉴定方法。该方法适用于各种桑葚果汁及加工品的掺伪鉴定,可为食品中桑葚源性成分定性、定量检测提供了技术支撑。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.44;O657.3
【图文】：

内源基因,高等植物,水果

河北农业大学全日制硕士专业学位（毕业）论文）高等植物内源 PCR 扩增结果以 TRNALue 植物内源对 21 种水果 PCR 扩增产物跑胶验证。结果（如图空白对照没有扩增出条带，且引物二聚体少，说明体系良好未受到污染；、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨和猕猴桃这 21 种水果均扩增带，条带大小为 180 bp,说明所提取水果基因组为植物基因组，可用于后续

桑葚,特异性引物

表示样品中存在一些杂质，如碳水化合物、盐（胍盐）等，表4和表5可看出OD230/OD260的比值基本在 2.0 左右，说明提取 DNA 较为纯净，且其他杂质污染较少。由表 9 和表 10 可知，以上桑葚混合果汁的 DNA 浓度都在 25 ng/μL 以上。表 9和表 10 中混合果汁样品除 S13、S16、S21 这三个样品外 OD260/OD280的比值基本在1.8~2.0 之间；OD230/OD260的比值基本在 2.0 左右，说明提取 DNA 较为纯净，且其他杂质污染较少2.2.2 桑葚定性 PCR 结果分析2.2.2.1 引物筛选结果将设计好的 25 对引物分别与桑葚模板和水果混样模板进行 PCR，如图 2，结果显示(如图 2)，桑葚引物 sangshen_02、sangshen_03、sangshen_04、sangshen_05、sangshen_06、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24、sangshen_25 这 12 对引物扩增条带清晰，且没有非特异性扩增，因此最终将这 12 对引物的扩增产物进行测序分析。

序列,序列,测序,序列比对

桑葚及其产品数字 PCR 鉴定方法的建立及研究sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24这 8 对引物与原始序列在 DNAMAN 中进行序列比对。然后筛选出与原始序列差异最小的序列进行后续试验验证。结果显示（如图 3），sangshen_05、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_024 这 7 对引物与原始序列比较差异小，基本重合，突变位点少，且测序双峰稳定。sangshen_06 与原始序列比对差异大，且测序峰值混乱，不稳定。所以最后选定 sangshen_05、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24 这 7 对引物进行特异性验证。

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