新型冷冻罗非鱼鱼糜抗冻剂的筛选与作用机理研究

发布时间：2020-08-18 13:49

【摘要】：鱼糜制品加工是我国鱼类精深加工的一个重要发展方向。近些年,鱼丸、鱼糕、鱼肉香肠及模拟蟹肉等鱼糜制品深受消费者喜爱,鱼糜及鱼糜制品加工业具有一定的发展前景。罗非鱼在我国鱼类贸易中占较大比例,其滋味可口、肉质厚、蛋白质含量丰富,以它为原料制作鱼糜具有一定的发展空间。传统商业抗冻剂甜度高,热量大,不利于某些特殊人群,因此有必要筛选绿色新型抗冻剂。近年来,蛋白质组学在食品领域的应用取得了一定成就,如双向电泳(2-DE)技术、非标记定量蛋白质组学技术(label-free)、同重同位素标记的相对和绝对定量蛋白质组学技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)及蛋白质全谱分析(Shotgun)等。目前有学者利用label-free技术研究了罗非鱼片贮藏期间蛋白质的差异性与其品质间的相关性,而关于抗冻剂对鱼糜的抗冻作用机理的蛋白质组学研究鲜有报道。鉴于此,本文以罗非鱼鱼糜为研究对象,进行了以下研究:(1)采用SDS-PAGE凝胶电泳、鱼糜凝胶状况及蛋白质理化性质指标等研究了表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)在冷冻罗非鱼鱼糜贮藏过程中所起的抗冻作用,并初步讨论了EGCG对鱼糜的抗冻作用机理。(2)利用iTRAQ蛋白质组学技术研究EGCG组鱼糜和空白组鱼糜中的蛋白质丰度差异,在蛋白质层面上详细分析了EGCG对冷冻罗非鱼鱼糜的抗冻机理。(3)将EGCG与紫菜琼胶进行复配,并与传统商业抗冻剂(4%蔗糖、4%山梨醇和0.3%多聚磷酸盐混合物)对比,研究了新型抗冻剂对冷冻罗非鱼鱼糜的抗冻作用效果。主要研究结果如下:1.在冻藏过程中,各组罗非鱼鱼糜盐溶性蛋白含量、总巯基含量及Ca~(2+)-ATPase活性均随冻藏时间的延长而降低,蛋白质羰基值逐渐升高,鱼糜凝胶强度和持水性显著降低。EGCG能通过共价键或非共价键的作用与蛋白质疏水基团结合,延缓疏水基团的释放,从而阻止肌原纤维蛋白的降解变性,还能清除活性自由基团以及与金属离子螯合,延缓蛋白质羰基化,最终达到抗冻效果。此外,EGCG能有效抑制肌球蛋白重链(MHC)、肌动蛋白(Actin)以及未知名蛋白质(Ⅰ、Ⅱ)的降解,而MHC降解程度与鱼糜品质有关联;EGCG对冷冻罗非鱼鱼糜的抗冻作用效果与EGCG添加量不成正比,其添加量过大的话,反而会导致鱼糜品质劣化,添加量为0.01%时,效果最佳。2.添加了EGCG的鱼糜组与空白组鱼糜一共鉴定到了1769个蛋白质,其中具有显著差异的蛋白质有36个。经过生物信息学分析后,鉴定到的36个差异蛋白主要包括结构蛋白、转录、翻译及调控蛋白和代谢酶类。EGCG主要是通过抑制结构蛋白的降解、代谢酶的活性以及鱼糜中微生物增殖所必须的蛋白质的合成,从而达到抗冻效果。3.EGCG与紫菜琼胶复配之后的新型抗冻剂对冷冻罗非鱼鱼糜的抗冻效果比单纯添加EGCG的效果要好,与传统商业抗冻剂有一定差距,但是在抑制蛋白质氧化方面效果最佳。此外,新型抗冻剂添加量很少,且拥有低甜、低热的特点,拥有较好的应用前景。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.4
【图文】：

空白,条带,肌球蛋白轻链,蛋白质

由图 2-4 可知，能够清晰的看到肌球蛋白重链（MHC）、肌动蛋白（Actin）、原肌球蛋白（Tropomyosin）和 5 个未知名条带。图中没有出现肌球蛋白轻链（MLC），可能的原因是长时间的贮藏导致轻链降解。此外，EGCG 添加组的 MHC、Actin 以及未知名蛋白质（Ⅰ、Ⅱ）条带颜色较空白组深，而 Tropomyosin和未知名蛋白质（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）条带与空白组基本相同，说明 EGCG 对 MHC、Actin 以及未知名蛋白质（Ⅰ、Ⅱ）具有一定的保护作用，而对 Tropomyosin 和未知名蛋白质（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）的降解没有明显抑制作用，最后，添加了 0.01%EGCG的组蛋白条带颜色最深。结果表明，冷冻罗非鱼鱼糜在贮藏过程中，肌原纤维蛋白容易受到冷冻变性、氧化变性、自身蛋白酶及微生物蛋白酶共同作用而降解。另外，空白组降解速率明显快于 EGCG 添加组，故 EGCG 在一定程度上能够延缓肌原纤维蛋白的降解和变性，且添加质量分数为 0.01%的 EGCG 效果最佳。Sun 等[69]研究了青苹果多酚对草鱼（Ctenopharyngodoni dellus）鱼糜的影响，发现添加青苹果多酚的组肌原纤维蛋白条带密度明显比空白组高，且此研究还能略微看到肌球蛋白轻链（MLC）条带。Marker 空白组 0.0025% 0.01% 0.02% 0.03%

海洋大学,蛋白质组学,硕士学位论文,白质

匹配蛋白质的肽段数量与分布图

数量分布,鱼糜,尼罗罗非鱼,丰度

27图 3-5 EGCG/CON 尼罗罗非鱼鱼糜中丰度差异蛋白的等级聚类分析g. 3-5 Hierarchical cluster analysis of differential abundance proteins in Nile tilapia surimEGCG/CON蛋白质组学分析中通常依据“FC＞1.2 或 FC＜0.83，P＜0.05”两个标不同丰度差异蛋白质的量。图 3-3 是不同丰度差异蛋白的火山图，红色表 0.01%EGCG 添加组相对于空白组鱼糜上调的蛋白质，绿色的点 B 代的蛋白质，而灰色的点 C 则被认为是无明显变化的蛋白质；图 3-4 是不异蛋白数量分布图，图中能够清楚看到两组鱼糜蛋白数量变化情况；图了 EGCG 组与空白组罗非鱼鱼糜中丰度差异蛋白的等级聚类分析，其中

【参考文献】