果汁中樱桃源性成分识别及定量检测技术研究

发布时间：2020-08-18 15:06

【摘要】：随着人民生活质量的提高,人们对营养价值的追求也越来越高,食品安全质量问题越来越成为人们关注的焦点。樱桃作为第三代水果品种之一,具有极高的营养价值和功能性成分,具有降低糖尿病、抑制代谢紊乱、抗氧化、抗炎、抗癌等功效。因为樱桃味道鲜美,口感独特,价值高昂,为了获得更多利润,在樱桃果汁等产品中掺假、制假成为可能,因此,快速准确的检测果汁中樱桃成分可为樱桃及其制品的产品质量监控提供技术支持。(1)樱桃物种特异性序列的查找。通过NCBI获得樱桃、草莓、猕猴桃等19种常见水果共41套基因组。利用Perl语言进行BLAST序列比对,最后挑选出了9对对樱桃特异性强扩增效果好的引物,其扩增产物测序后确定了樱桃基因组中特异性区段的DNA序列。(2)樱桃物种鉴别特异性PCR方法的建立。以樱桃、草莓、猕猴桃等19种常见水果基因组DNA为模板,对上述9对引物进行了特异性检测,PCR体系和退化温度的优化以及灵敏度的测定。结果表明,在9对引物中,che36-F/R引物对扩增效果和特异性最好。在引物浓度为0.4μmol/L、退火温度为58℃时,PCR鉴别法的灵敏度最好,可达0.5%。实际样品测试表明此方法可用于混合鲜榨果汁和非鲜榨果汁中樱桃成分定性鉴别。(3)樱桃物种鉴别特异性实时荧光PCR方法的建立。根据樱桃基因组DNA特异性区段che36序列设计了两对引物和探针。qPCR体系和程序优化后,che36-1-QF/QR/QP在引物和探针浓度均为0.5μmol/L时,灵敏度可达0.1%。最优扩增条件下,制作的标准曲线为y=-3.356x+31.062,R~2=0.998,扩增效率为98.545%,Ct值与樱桃基因组DNA模板量之间具有y=-1.457ln(x)+29.367的关系,相关系数R~2为0.9985。通过样品的测试证明此方法可用于定性鉴别混合鲜榨果汁、非浓缩果汁中樱桃成分,并能测定樱桃基因组DNA的含量。(4)樱桃物种鉴别特异性数字PCR方法的建立。ddPCR反应体系和程序优化后,che36-1-QF/QR/QP在引物浓度为0.5μmol/L、探针浓度为0.2μmol/L、退火温度为56.7℃时,ddPCR扩增效果最好,线性定量范围下检测限为0.24ng樱桃基因组DNA。特异性区段che36的拷贝数和DNA模板量之间具有y=7.4093x+1.2482的线性关系,且相关系数R~2=1。通过样品的测试证明此方法可用于定性鉴别混合鲜榨果汁、非浓缩果汁和浓缩果汁中樱桃成分,并能得到樱桃特异性片段che36拷贝数。本研究建立了樱桃物种特异性鉴定方法,为果汁中樱桃源性成分的鉴定提供了技术支撑,同时为食品质量安全控制提供了试验依据。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.44
【图文】：

序列,物种特异性,语言分析,百分比

10μmol/L F 1.0 2 40 s/95℃10μmol/L R 1.0 3 30 s/58℃40DNA 模板（25ng/μL） 2.0 4 40 s/72℃ddH2O 8.5 5 10min/72℃ 1总体积 25 6 4℃ ∞2.2 结果与分析2.2.1 生物信息学分析结果通过 Perl 语言分析最终得到了 28800 个樱桃物种特异性条带结果。根据特定百分比（Specific Percent），此值越高说明比对的序列相似性越低。根据特定百分比从 28800中值筛选出最优的 40 条 300~700bp 之间的片段，将这 40 条序列在 NCBI 上 BLAST（如图 1~17），筛选出特异性较强的 17 对序列。

序列,物种特异性,语言分析,百分比

2.2.1 生物信息学分析结果通过 Perl 语言分析最终得到了 28800 个樱桃物种特异性条带结果。根据特定百分比（Specific Percent），此值越高说明比对的序列相似性越低。根据特定百分比从 28800中值筛选出最优的 40 条 300~700bp 之间的片段，将这 40 条序列在 NCBI 上 BLAST（如图 1~17），筛选出特异性较强的 17 对序列。图 1 che01 扩增序列 BLAST 比对结果Figure 1 BLAST result of che01 amplification sequence

果汁中樱桃源性成分识别及定量检测技术研究

che07扩增序列BLAST比对结果

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