酵母细胞壁对梨和番茄果实采后病原真菌抗性的诱导作用及相关机理研究

发布时间：2020-08-22 08:19

【摘要】：真菌病害是引起果蔬采后巨大损失的原因之一。利用拮抗酵母抑制果实采后病害,被认为是一种最有希望替代化学杀菌剂的新型病害防治技术,受到了国内外越来越多的关注和研究。通过近30年的研究表明,生防酵母的拮抗机理主要包括营养与空间竞争、诱导果实抗性、分泌水解酶和吸附作用等。在这些机理中,诱导宿主抗性被认为是抑制病原菌的重要因素之一,其与果实的多种生理代谢活动密切相关。本课题组在前期研究中初步探明了拮抗酵母灭活菌体及其细胞壁能够诱导梨果实对青霉病的抗性,但拮抗酵母细胞壁诱导果实抗性的分子机理尚不明确。本论文主要以酵母细胞壁与梨果实和番茄果实为研究对象,探讨了酵母细胞壁诱导果实抗性依赖的物质基础及其相关的生物学机制。主要研究结果如下:(1)酵母细胞壁诱导梨果实青霉病抗性的物质基础分析对比分析了8株拮抗酵母、酿酒酵母、毕赤酵母的活体细胞、灭活菌体和酵母细胞壁对果实病害的抑制效力,研究表明:除了酿酒酵母和毕赤酵母外,8株拮抗酵母均能够大幅度的降低梨果实采后青霉病的发生;同时,灭活的酵母菌体及酵母细胞壁均能诱导梨果实对青霉病的抗性,其中以海洋红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)的灭活菌体和细胞壁的效果最佳。对酵母细胞壁组分分析表明,不同来源的同种酵母细胞壁组成上具有高度相似性,但不同种拮抗酵母的细胞壁组成上差异较大。进一步对细胞壁多糖组分的分析表明,来源于酿酒酵母和红冬孢酵母细胞壁的几丁质、β-1,3-D-葡聚糖和β-1,6-D-葡聚糖均能诱导梨果实产生对青霉病的抗性,而甘露糖蛋白对梨果实青霉病的抗性没有显著的影响。(2)酿酒酵母细胞壁几丁质的结构鉴定及对番茄果实抗性的诱导作用采用乌氏粘度计、高效液相色谱(HPLC)、傅里叶红外光谱(FTIR)和核磁共振(NMR)对酿酒酵母细胞壁几丁质的结构进行了表征,并探究了其对番茄灰霉病的防治效力及相关机理。研究结果表明,酵母细胞壁几丁质由单糖N-乙酰氨基葡萄糖组成,分子量为4.68×10~5 Dalton,脱乙酰度为45.83%。几丁质不能直接抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的生长,但可以显著诱导番茄果实对由B.cinerea引起的灰霉病的抵抗能力,且诱导效果与处理浓度和诱导时间密切相关。进一步的分析结果表明,酵母细胞壁几丁质诱导了果实组织中活性氧(ROS)的积累和胼胝质的沉积;同时提高了果实防御相关酶(SOD,CAT,POD,PAL,GLU和CHI)活性的增加及其相应的基因的上调;而且酵母细胞壁几丁质处理还激活了水杨酸信号通路关键基因(ICS,NPR1,TGA1a,TGA2,PR1b1和PR5)的上调表达。(3)酿酒酵母细胞壁β-1,3-D-葡聚糖的结构鉴定及生防效力评价通过乌氏粘度计、HPLC、FTIR和NMR等技术手段对β-1,3-D-葡聚糖的分子量(M_w)、单糖组成、特征性官能团和碳氢信号进行了表征。结果表明,分离得到的β-1,3-D-葡聚糖样品由单糖葡萄糖组成,分子量为165 kDa,葡萄糖分子间通过β-1,3糖苷键连接。在诱导果实抗性方面,β-1,3-D-葡聚糖不能直接影响扩展青霉(Penicillium expansum)孢子在体外和果实伤口处的萌发,而β-1,3-D-葡聚糖诱导处理显著抑制了果实伤口处P.expansum孢子的萌发。扫描电镜(SEM)观察β-1,3-D-葡聚糖处理对梨果实伤口组织超微结构影响的结果表明,β-1,3-D-葡聚糖可以在细胞组织水平上提高对P.expansum的抗性。RT-qPCR结果表明,β-1,3-D-葡聚糖处理显著提高了果实伤口周围组织中PR1、GLU、endoGLU9、CHI3、CHI4、endoCHI、PR4、PR5和PAL基因的上调表达,进而降低了梨果实青霉病腐烂的发病率和病斑直径。(4)酵母细胞壁葡聚糖合成相关基因Rho1的遗传转化及其生防效力评价利用特异性引物从酿酒酵母基因组DNA中扩增得到目的基因Rho1全长序列,克隆至载体pYES6/CT后,通过电转化技术导入至酿酒酵母中,测序鉴定后成功得到过表达酿酒酵母菌株SC/Rho1。RT-qPCR结果显示,诱导培养12 h后重组子SC/Rho1中Rho1基因的表达量较野生型菌株上调了107.89倍。同时,重组子SC/Rho1细胞壁中葡聚糖含量增加了9.26%。诱导抗性结果表明,诱导培养后的酵母细胞壁显示出对梨果实更强的诱导效果。(5)酵母细胞壁β-1,3-D-葡聚糖对诱导梨果实青霉病抗性的转录组学分析对β-1,3-D-葡聚糖和病原菌处理后的梨果实组织进行转录组学分析。结果表明,经酿酒酵母细胞壁β-1,3-D-葡聚糖与病原菌处理后的梨果肉组织相比于对照组有5984个基因上调表达,8769个基因下调表达。β-1,3-D-葡聚糖可能通过激活了梨果实细胞中模式分子识别受体FLS2、CNGCs和钙离子信号通道,引发了下游的激素信号生长素、茉莉酸、赤霉素和乙烯的传导,导致防御相关转录因子(MYC2、PTI5、PTI6、WRKY29和WRKY33)的表达,进而产生一系列的防御反应,包括防御相关基因POD、PAL、HSP90和PR1的变化、氨基酸的生物合成和代谢,以及次级代谢通路的激活,从而抑制了梨果实青霉病的发生和发展。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.612.1;S436.412.1;TS255.3
【图文】：

示意图,抗性机制,获得性,叶子

图 1-1 拟南芥叶子中系统获得性抗性机制示意图（Fu & Dong, 2013）Fig. 1-1 Schematic representation of the action mechanism of system acquired resistance inArabidopsis leaves.目前，大量 SAR 化学诱导剂被报道，包括水杨酸及衍生物水杨酸甲酯

示意图,植物细胞,内水,甲基转移酶

图 1-2 植物细胞内水杨酸代谢通路激活示意图（Kumar, 2014）Fig. 1-2Amodel showing activation of SAsignaling in a plant cell.如图 1-2 所示，当诱导剂进行诱导或病原菌攻击植物时，脂质体通过 ICS/径开始合成 SA。水杨酸甲基转移酶（SAMT）催化 SA 向 MeSA 的转化

示意图,茉莉酸,信号通路,拟南芥

图 1-3 拟南芥中茉莉酸（JA）信号通路示意图（Carvalhais, Schenk, & Dennis, 2017）Fig. 1-3 Schematic representation of the regulation of JAsignal pathway in Arabidopsis.如图 1-3 所示，当植物遭遇外界环境刺激后，细胞内迅速合成 JA 信号分子。合成的 JA 与氨基酸 L-Ile 结合产生具有活性的（3R,7S）-茉莉酮基-L-异亮氨酸

【参考文献】