基于SERS结合免疫层析技术检测β-伴大豆球蛋白的方法研究

发布时间：2020-09-08 22:35

　　 β-伴大豆球蛋白是大豆中重要的贮藏蛋白,同时也是大豆主要过敏原之一,会引发食物过敏危害人体健康。目前食物过敏在临床上尚未有有效的预防及根除方法,唯一安全有效的措施是避免食用及接触过敏原。对于大豆潜在过敏患者和大豆及其副产品加工企业,建立β-伴大豆球蛋白的定量检测方法显得尤为重要。由于表面增强拉曼散射技术具有高灵敏度、高亲和力、指纹式的分辨能力,并能使信号强度增强6~10个数量级等优点。因此,本论文基于β-伴大豆球蛋白抗体的制备,组装β-伴大豆球蛋白快速检测的双抗体夹心方法,并尝试建立新型以胶体金为活性基底的拉曼增强免疫试纸检测方法,为过敏消费者食物中过敏原的检测提供方便快捷的检测工具。本课题的主要研究内容如下:1.通过等电点沉淀法分离提取,硫酸铵沉淀法纯化制备β-伴大豆球蛋白。将β-伴大豆球蛋白按照免疫程序免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA法鉴定获得效价高达1:12800的多克隆抗体,其敏感性IC_(50)值达到718 ng/mL,与芝麻蛋白、麦胚球蛋白交叉反应率小于0.2%,与花生蛋白交叉反应率为5.6%,与大豆球蛋白交叉反应率为8%。2.通过细胞融合技术将高效价及强敏感性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞,通过筛选及亚克隆获得产特异性抗体的细胞株3C9和3D11,经体内诱生法大量制备单克隆抗体,得到两株单抗3D11 mAb、3C9 mAb。两株单克隆抗体亚型鉴定均为重链IgG1型,轻链Kappa型,且特异性良好,均与α’亚基反应最强烈;间接ELISA测定3D11 mAb效价达到1:1.28×10~5,其半数抑制浓度IC_(50)值为911 ng/mL,亲和力常数为9.6×10~9 L/moL;间接ELISA法测定3C9 mAb效价达到1:2.56×10~5,其IC_(50)值为2.91μg/mL,亲和力常数为1.42×10~(11) L/moL。并利用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,纯化后单克隆抗体纯度提高到72%。3.建立以β-伴大豆球蛋白的兔源多克隆抗体作为检测抗体和以3D11 mAb作为固定化捕捉抗体的双抗体夹心免疫层析试纸方法。经4-氨基苯硫酚修饰胶体金并结合抗体制备成拉曼免疫探针,建立表面增强拉曼侧向免疫层析试纸的快速检测方法。SERS-LFA法在160 ng/mL~100μg/mL范围可对样品中β-伴大豆球蛋白含量的进行检测,其满足y=65.1360x+113.9210,R~2=0.9636,检测限为32 ng/mL。
【学位单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS214
【部分图文】：

Western blot 鉴定白凝胶电泳后，在 200 mA 的电流、80 V 的电压下，将 PVDF 膜封闭 1 h，洗膜，与鼠多抗血清反应孵育 1 h，洗膜后平整放入暗匣准备显色。将 EC取出胶片压到膜上，压片时间视发光强弱选择，经DS-PAGE 鉴定白的 SDS-PAGE 电泳鉴定结果如图 1，β-伴大豆球 Gel-Pro analyzer 软件分析，α’，α 和 β 分子量分别量分别约为 29.0%、25.7%、16.2%，β-伴大豆球M 1

河南工业大学硕士学位论文价是指在任何筛选实验中均能和抗原出现明显的、可检测到的反应倒数[77]。每次免疫后第十天检测效价，五次免疫的平均变化趋势如映出数只小鼠平均血清最大稀释度在不断上升，60 μg 的免疫量小鼠升更快，但实际上在五免时就有小鼠效价达到 1:12800，在六免时维免结果如表 6，根据 OD检测孔/OD阴性孔≥2.1 为阳性，可得：一二组小在 1:6400 及以上，选用高效价的小鼠进行加强免疫以用于后续单克

抗体均能产生抑制，且血清抑制率与竞争蛋白浓度呈对数关系。其中敏感性最好，图 3 为 6 号鼠源多克隆抗体间接竞争 ELISA 抑制曲线回归方程可以求出在线性范围 75～4800 ng/mL 时，该鼠源多克隆抗白的半数抑制率 IC50为 718 ng/mL，相关系数 R2=0.9802。表 7 间接竞争法测定小鼠多抗血清抑制效价竞争蛋白浓度（ng/mL）空白半00 2400 1200 600 300 150 75 010 0.285 0.419 0.546 0.673 0.709 0.796 0.834 0.052 67 0.232 0.347 0.430 0.493 0.592 0.683 0.787 0.048 00 0.352 0.383 0.537 0.640 0.651 0.678 0.760 0.050 79 0.234 0.338 0.435 0.509 0.570 0.630 0.665 0.049 57 0.223 0.264 0.333 0.418 0.370 0.526 0.547 0.050 28 0.144 0.210 0.295 0.335 0.386 0.470 0.532 0.048

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