鳕鱼鳔胶原蛋白和胶原肽特性及对细胞衰老进程干预作用与机制

发布时间：2020-09-21 08:03

　　自21世纪以来,随着社会的不断发展与人类寿命的不断增加,我国乃至全球范围内均已出现了人口老龄化的现象。根据联合国世界人口展望报告测算的中国人口年龄结构图显示,我国的各年龄段人口分布已由上世纪七十年代的三角形到如今的纺锤型。人口老龄化社会的到来必然带来家庭结构和社会结构的变化,家庭物质供养与生活照料等方面的缺乏无疑增加了中年人的压力;老龄疾病与医疗保健费用的增加也加重了社会负担。因此,为延缓衰老或预防衰老相关疾病的发生,研究并开发有效的抗衰老药物对提高老年人生活质量,减轻社会和国家的负担具有重要意义。随着人口老龄化形势的不断加重,对抗衰老产品的种类与需求量也日益增多,与药品相比,具有延缓衰老活性的功能食品避免了药物研发周期、临床试验周期长的缺陷,具有更广阔的发展空间。鱼鳔,又名花胶或鱼肚,以其胶原蛋白含量极高而著称,且自古以来就以各种功效深受消费者的青睐。对于胶原蛋白与抗衰老之间的关系,目前研究颇多的是大分子胶原蛋白与小分子胶原肽在护肤品行业的应用,以皮肤成纤维细胞及动物皮肤组织为实验对象探究胶原蛋白对其衰老的延缓功效;而对于胶原蛋白与延缓机体衰老的关系,近年来也成为了研究的热点。此前已有研究表明,其他品种来源的鱼鳔酶解产物具有较好的抗氧化活性,而提高机体抗氧化能力是通过清除氧自由基防止机体氧化损伤实现延缓衰老的最佳途径之一。因此,本文以大西洋鳕鱼鳔为原料,采用不同方式提取鳕鱼鳔胶原蛋白与酶解胶原肽并对其进行理化特性的分析与比较;通过单因素实验与响应面优化实验确定多肽的最佳制备工艺,对其体外清除自由基能力进行测定并检测其体外模拟肠消化的稳定性;对最佳工艺条件下提取的鳕鱼鳔多肽进行分离纯化与结构鉴定;以2BS细胞为研究对象建立早熟性衰老与复制性衰老细胞模型,检测了两种鳕鱼鳔胶原肽对衰老的干预作用并通过相关信号通路蛋白表达的变化对作用机制进行分子水平的探讨。采用三种不同的提取方式对鳕鱼鳔胶原蛋白与胶原肽进行提取并对其理化特性进行分析与比较。采用低温酸溶提取酸溶性胶原蛋白(acid-soluble collagen,ASC),热水抽提明胶(gelatin,GEL),复合蛋白酶酶解制备鳕鱼鳔胶原肽(swim bladder peptides,SWP)得到三种鳕鱼鳔胶原蛋白与胶原肽。对提取的蛋白质进行感官评定、SDS-PAGE电泳分析、紫外光谱分析、傅里叶红外光谱分析、氨基酸组成分析与扫描电镜分析。基本组成成分的结果显示实验所用的鳕鱼鳔样品中水分含量较高,达到76%,其次是蛋白质,含量高达22.08%,若以干基计,蛋白质含量可达92%。ASC、GEL与SWP三种胶原蛋白的提取率分别为42.15%、72.20%与89.11%,且羟脯氨酸的含量为8.73%、8.97%与7.94%;在外观形态上,ASC与GEL呈致密的海绵状,SWP为粉末状固体;SDS-PAGE图谱显示ASC至少由两条α链与一条β链组成,GEL中存在少量的α链,SWP种α链与β链被降解;紫外光谱结果显示三种蛋白在230 nm波长处均有最大吸收;且GEL与SWP在280 nm波长处有一定的吸收;扫描电镜结果显示ASC与GEL具有一定的交联结构,SWP中无交联结构存在。以上结果表明鳕鱼鳔是一种高蛋白低脂肪食品,且三种不同提取方式制备的胶原蛋白具有不同的特性,为鳕鱼鳔胶原蛋白的开发与应用拓宽了领域。选用六种不同蛋白酶对鳕鱼鳔进行酶解,通过比较酶解液的水解度与对DPPH自由基清除能力,筛选最佳蛋白酶,进而通过单因素实验与响应面优化实验确定最佳提取工艺。通过体外模拟胃肠消化系统对酶解产物进行体外胃肠模拟消化,检测消化前后胶原肽水解度与清除自由基能力的变化。抗氧化肽酶解工艺优化实验确立了最佳提取条件为:酶解时间6 h,pH 7.2,温度58.6℃,酶添加量为200 U/mL,所得酶解液的DPPH自由基清除率达到61.1%。体外自由基清除实验结果显示鳕鱼鳔胶原肽对DPPH·、HO·与O_(2-)·均有较好的清除能力,其IC_(50)分别为8.29 mg/mL、5.43 mg/mL与5.03 mg/mL;且对亚铁离子具有很好的螯合能力,IC_(50)为1.35 mg/mL。体外模拟胃肠消化实验结果表明了经胃肠消化后鳕鱼鳔胶原肽的水解度增大,但体外抗氧化能力有一定程度的下降,其可能原因为在模拟胃肠消化过程中因反应条件的变化如pH值的改变对多肽的组成及结构产生一定的影响,进而改变了多肽的生物活性。将最佳提取工艺得到的鳕鱼鳔胶原肽进行G-15葡聚糖凝胶分离层析,对得到的主要组分进行理化性质分析,包括紫外光谱分析、傅里叶红外光谱分析、氨基酸组成分析与与分子量分布检测;同时对纯化组分的体外清除自由基能力进行测定,比较不同分子量的组分的体外抗氧化能力。G-15凝胶层析分离纯化后获得两个主要组分,分别命名为SWP-I与SWP-II。理化性质结果显示两个组分中的主要氨基酸组成是Asp、Glu、Gly、Ala与Pro,其中SWP-I中含量最高的氨基酸是甘氨酸,而SWP-II中含量最高的氨基酸是精氨酸;紫外光谱扫描结果显示两个组分在230 nm波长处均有最大吸收,符合蛋白质的吸收特性,且SWP-II中芳香族氨基酸含量高于SWP-I,该结果与氨基酸组成分析结果相一致;分子量分布测定结果显示SWP-I与SWP-II的数均分子量分别为4976 Da与1960 Da。体外自由基清除实验显示两个组分对DPPH·,HO·与O_2-·有较好的清除能力且有很好的亚铁离子螯合能力,SWP-II的体外抗氧化能力优于SWP-I。生物体的衰老发生在机体的每一个层面,包括从分子到组织、器官以及生命的基本单位——细胞,细胞衰老被认为是人类衰老的基础。在细胞衰老进程的相关研究中,人胚肺二倍体成纤维细胞(human embryonic lung diploid fibroblast,2BS)常常被选为模式细胞种类,也是目前国际上公认的用以研究人体衰老最好的模型之一。建立细胞水平的衰老模型对衰老进程的相关研究以及探寻抗衰老的药物都具有极为重要的意义。本文通过建立H_2O_2诱导2BS细胞早熟性衰老细胞模型,探究了鳕鱼鳔胶原肽对早熟性衰老2BS细胞的保护作用及机制研究。通过cck-8检测不同浓度H_2O_2对细胞增殖率的影响从而选择0.2 mM的H_2O_2浓度建立氧化诱导2BS细胞早熟性衰老模型;然后分别检测了鳕鱼鳔胶原肽两个组分对H_2O_2诱导2BS细胞的细胞增殖率、细胞内活性氧含量、细胞β-半乳糖苷酶含量、细胞凋亡率以及细胞内氧化物酶与脂质过氧化物含量的影响;通过检测PI3K/Akt凋亡信号通路中t-Akt、p-Akt、t-GSK-3β与p-GSK-3β蛋白的表达探讨鳕鱼鳔胶原肽对氧化诱导细胞早熟性衰老细胞保护作用的分子机制。结果显示两个组分的高浓度组均能显著提高早熟性衰老细胞增殖率(p0.01,p0.01),并显著降低细胞内ROS活性氧水平(p0.01,p0.01)、β-半乳糖苷酶含量(p0.01,p0.01)与细胞凋亡率(p0.01,p0.01),同时提高细胞内抗氧化酶活力并降低脂质过氧化物含量(p0.01,p0.01)。通过分子水平检测PI3K/Akt信号通路中蛋白表达情况,结果显示SWP-I与SWP-II能够通过抑制p-Akt与p-GSK-3β水平的升高来发挥对早熟性衰老细胞的保护作用,抗衰老效果呈现良好的剂量依赖且SWP-II的作用效果优于SWP-I。对于鳕鱼鳔胶原肽延缓2BS细胞复制性衰老的作用及机制研究,本实验分别检测了鳕鱼鳔胶原肽两个组分对不同代龄细胞的促增殖作用、对不同代龄细胞内活性氧含量、β-半乳糖苷酶含量、过氧化物酶的含量以及细胞凋亡率的影响;并通过彗星实验拖尾长度反映鳕鱼鳔胶原肽对复制性衰老细胞中DNA损伤修复的影响;通过检测抗p53/p21抗凋亡信号通路中p53与p21蛋白的表达探讨鳕鱼鳔胶原肽延缓细胞复制性衰老进程的机制。结果显示与20PD年轻细胞相比,鳕鱼鳔胶原肽两个组分能显著提升45PD复制性衰老细胞的增殖率(p0.01,p0.01),同时显著降低细胞内ROS活性氧水平(p0.01,p0.01)与β-半乳糖苷酶含量(p0.01,p0.01),显著减少细胞凋亡率(p0.05,p0.01)与减轻DNA损伤中拖尾长度(p0.01,p0.01),并提高细胞内抗氧化酶活力并降低脂质过氧化物含量,从而实现对复制性衰老细胞的保护作用。其可能的分子机制为通过下调p53/p21细胞周期与凋亡蛋白信号通路中p53与p21蛋白的实现对细胞复制性衰老进程的调控。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS254.9
【部分图文】：

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图 2-1 鳕鱼鳔胶原蛋白图片Fig. 2-1 The pictures of collagens of cod swim bladder（a）ASC；（b）GEL；（c）SWP2.3.3 鳕鱼鳔胶原蛋白提取率对三种提取方式获得胶原蛋白总质量进行称重并计算蛋白提取率，结果如表2-3 所示。可以看出提取方式的不同对鳕鱼鳔蛋白的提取率影响较大，若以湿基计，酸溶性胶原蛋白的提取率最低，约为 10.23%，其次是热水抽提明胶，提取率得到一定的提升，达到 17.51%，酶解鳕鱼鳔胶原肽的提取率最高，可达 21.62%。若以干基计，提取率分别为 42.15%、72.2%与 89.11%。酸法提取中胶原蛋白分子间以醛基缩合的形式形成共价键以及分子交联，导致其在 0.5 M 醋酸中溶解度偏小；热水抽提过程使单分子胶原蛋白发生一定程度的变性，部分三级结构遭到破坏，增大了其在水溶液中的溶解度，进而增大了提取率；酶解法中复合蛋白酶中含有多种蛋白酶切位点，最大化地将大分子胶原蛋白切割成较小分子的多肽，因小分子多肽具有很好的水溶性，所以酶解蛋白获得的产物的得率最高。

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图 2-3 鳕鱼鳔胶原蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱Fig. 2-3 SDS-PAGE electropgoresis pattern of collagens from cod swim bladderNon：非变性蛋白上样缓冲液 Red：变性蛋白上样缓冲液2.3.5.3 紫外光谱分析对三种提取方式获得的胶原蛋白进行 190- 400 nm 范围内的紫外波长扫描，结果如图 2-4 所示。主要的吸收峰出现在 220- 230 nm 与 260- 280 nm 波段，三种胶原蛋白的紫外最大吸收峰都在 220- 230 nm 区间范围内，这是由于蛋白中的 C=O、-COOH 与 CO-NH2等的 n→π *电子跃迁所引起的，符合胶原蛋白的吸收特性。GEL与 SWP 在 260- 280 nm 波长处也具有一定的吸收，说明鳕鱼鳔明胶与鳕鱼鳔胶原肽含有一定量的芳香族氨基酸，ASC 在 260- 280 nm 波长处没有明显的吸收峰，说明酸溶性胶原蛋白中芳香族氨基酸含量较少。

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图 2-4 鳕鱼鳔胶原蛋白紫外光谱扫描图Fig. 2-4 UV-vis spectra of collagens from cod swim bladder.4 傅里叶红外光谱分析三种不同提取方式制备的胶原蛋白的傅里叶红外光谱如图 2-5 所示，可见蛋白的具有相似的红外扫描光谱，均由酰胺 A、B 与酰胺 I、II、III 组成在一定的差异。图谱显示，在波长为 3300-3340 cm-1区间为酰胺 A 带了 N-H 与 O-H 中氢键的伸缩振动吸收[6]，有研究报道由 N-H 基团伸缩振的吸收峰应该在 3400-3440 cm-1波长范围内，但若与其他基团形成氢键后方向迁移大约 100 cm-1，因此出现在 3300-3340 cm-1区间[90]，图谱中结果胶原蛋白中均有氢键的存在，符合胶原蛋白的特性，且 ASC 中的氢键交大，GEL 次之，SWP 最弱。2930cm-1波长附近的伸缩振动表明酰胺 B 的存-H 键的伸缩振动或=C-H 与 NH3+的非对称伸缩振动产生的，也可能是-C反对称伸缩振动引起的。在波长 1200-1700 cm-1范围内的三个吸收峰分别代表能反应多肽构象的

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