不同月龄乌珠穆沁羊骨骼肌肌内结缔组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的特性研究

发布时间：2020-10-13 04:44

　　 Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白是骨骼肌肌内结缔组织的主要纤维性胶原蛋白,在动物的不同生长阶段中其分布和特性有所变化,进而影响肌肉的嫩度。本研究采用自然放牧条件下的6、9、12、18月龄的乌珠穆沁羊,取其半腱肌和背最长肌,提取总RNA,采用实时荧光定量PCR方法对Ⅰ型胶原蛋白基因COL1A1、COL1A2和Ⅲ型胶原蛋白基因COL3A1在肌肉组织中的相对表达量进行了分析。并利用间接免疫荧光染色方法对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在骨骼肌肌内结缔组织中的分布状态进行了分析。并从肌肉组织中提取了Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,用SDS-PAGE方法和羟脯氨酸法对其进行了定性定量分析。建立了分离Ⅰ型胶原蛋白的双向电泳方法。结果表明,在不同的月龄间,I型胶原蛋白基因COL1A1和COL1A2和Ⅲ型胶原蛋白的相对表达量在9、12月龄中相对较高。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的含量随着月龄的增长而显著增加(p0.05),并且半腱肌肌内结缔组织中Ⅰ型胶原蛋白的含量显著高于背最长肌(p0.05)。Ⅰ型胶原蛋主要分布在肌内膜和肌束膜,Ⅲ型胶原蛋白主要分布在肌内膜,少量分布在肌束膜。双向电泳方法分离Ⅰ型胶原蛋白的电泳条件为上样方式为水花上样,第一向等电点聚焦时间为50000 V·h上样量为640 μg/mL。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS251.53
【部分图文】：

图１骨骼肌肌内结缔组织的解剖图［％??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ａｎａｔｏｍｙ?ｏｆ?ＩＭＣＴ??）肌内膜、肌束膜、肌外膜的分层图（ｂ）朿状肌表层肌纤维厚肌与肌内肌间的网络结构屮的中？个肌原纤维（ｄ）围绕蜂窝状内肌网的较厚的膜周围的构??图?１?ａ?参考?Ｐｕｒｓｌｏｗ，２０１０；?Ｐａｇｅ：图?ｄ?和?ｅ?参考?Ｐｕｒｓｌｏｗ?＆?Ｔｒｏｔｔｅｒ?（１９９４））??肌内结缔组织成分??织的含量、空间分布和组成随肉的位置和动物年龄而细胞外基质（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）组成，肌纤由细丝（肌动蛋白）和粗丝（肌球蛋白）组成，细胞弹性蛋白、网状蛋白、蛋白多糖和糖蛋白ｍ１，胶原蛋白，例如：在牛肉中占肌肉干重的１％－１５％、猪肉中占干质量、禽肉中０．７５％－２％Ｍ，而弹性蛋白含量较少只有０．６％－３结缔组织蛋白中研宄最少的一种，网状蛋白由围绕细

内蒙古农业大学硕士学位论文试验步骤??适量的胶原蛋白待测样加入６ｍｏＬ／ＬＨＣｌ使其浓度为（５ｍｇ／ｍＬ）?充分水解。１６０００卬〇１，２５°（：离心２〇１１１丨１１。取上清液用１〇１＾［＾８范围内。蒸循水定容至８?ｍＬ，取上清液待测。取２?ｍＬ待测液加室温孵育２０?ｍｉｎ。ｌｍＬ?Ｅｈｒｌｉｃｈ’ｓ?Ｒｅａｇｅｎｔ溶液室温放置５?ｍｉｎ。充锅内孵育２０?ｍｉｎ。冷却在５６０?ｎｍ测吸光度。胶原蛋白含量＝羟脯氨１羟脯氨酸标准曲线的制作??配置１５?ｍｇ／ｍＬ羟脯氨酸标准溶液，然后将标准溶稀释为１５、７．５９３８、０．４６９、０．２３４、０．１１７?（ａｇ／ｍＬ?标准溶液。各取?２?ｍＬ?待测液加，室温鮮育２０?ｍｉｎ。ｌｍＬ?Ｅｈｒｌｉｃｈ’ｓ?Ｒｅａｇｅｎｔ溶液。充分混合后６０??ｍｉｎ。冷却在５６０?ｎｍ处测吸光度，以吸光度为ｙ轴经脯氨酸浓曲如图所示。??

图３?ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳图??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ??不同月乌珠穆沁羊背最长肌和半腱肌内提取ＲＮＡ的结果如图３所示。紫外分??光光度计测定总ＲＮＡ浓度及ＯＤ２６〇／２？）值，然后在１．５％琼脂糖凝胶电泳证实。电泳??检测的结果显示２８Ｓ、１８Ｓ条清晰，没有其它杂条带，说明ＲＮＡ没有被降解，紫外??分光光度计检测浓度及ＯＤ２６〇／２８Ｇ值结果见附录，ＯＤ２６Ｇ／２８〇值均在１．８－２．０之间。可??用于ｃＤＮＡ的合成和实时荧光定量ＰＣＲ试验。??４．?１．２实时荧光定量ＰＧＲ扩增产物的鉴定??图４目的基因和内参基因的ＰＣＲ扩增产物??Ｆｉｇ．４?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ?ａｎｄ?ｉｎｔｅｒｎａｌ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｇｅｎｅ??注：图?Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ?分别表示?ｐ－ａｃｔｉｎ、Ｃ０Ｌ１Ａ１、Ｃ０Ｌ１Ａ２、Ｃ０Ｌ３Ａ１，?Ｍ?表示?Ｍａｒｋｅｒ??
【参考文献】

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本文编号：2838746