金纳米三聚体生物传感器的构建及其在甲壳类原肌球蛋白检测中的应用

发布时间：2020-10-27 11:30

　　 近年来,由于人们生活水平的提高,由食物过敏引起的食品安全问题日益受到消费者的重视。甲壳类水产品由于其味道鲜美、来源广泛、营养经济价值高而受到广大消费者的欢迎,但甲壳类水产品作为易引起食物过敏反应的八大类食品之一,含有多种致敏成分。原肌球蛋白作为甲壳类水产品最主要的过敏原之一,其结构性质稳定,难以通过食品加工及烹饪过程消除其致敏原性。目前,除了避免过敏原摄入外没有较好的治疗食品过敏的方法,因此建立快速、准确地定量检测食品过敏原方法日益受到学界的关注。目前,甲壳类原肌球蛋白的定量检测方法主要为ELISA法和PCR法,但这两类方法普遍存在前处理复杂、操作成本高、操作复杂、精确性低并且需要大量的孵育反应时间等一系列缺点。因此基于上述问题,本研究旨在研究出一种快速、准确的甲壳类原肌球蛋白超敏检测方法。主要内容如下:1、通过酶切重组法构建刀额新对虾原肌球蛋白表达载体质粒pGEX4T-MBP-TROP-1O×His,并用热激法将重组质粒导入大肠杆菌BL21 E.coil中体外重组表达刀额新对虾原肌球蛋白。通过Tev酶对重组原肌球蛋白进行修饰后经Histrap HP亲和层析柱对其进行纯化,最终获得高纯度重组原肌球蛋白,经高效液相层析色谱质谱联用鉴定该蛋白为Met e1(Metapenaeus ensis)分子量为32.8kD,BCA法测定其浓度最高可达1.8460 mg·tmL-1。通过间接性ELISA比较重组原肌球蛋白与通过丙酮粉-盐析法得到的天然刀额新对虾原肌球蛋白的致敏性。结果表明,两种蛋白其致敏能力相似,且最适ELISA条件额为包被抗原浓度为0.5 μg·mL-1,最佳血清稀释倍数为1000倍。2、通过柠檬酸钠还原四氯金酸法制备金纳米粒子,并用TEM、UV-vis、DLS对其进行理化表征,最终选用平均粒径为33.82 nm的金纳米粒子表面修饰抗原肌球蛋白单克隆抗体、21.04nm的金纳米粒子表面修饰重组原肌球蛋白。以体积比4:1的比例混合金标抗体与金标抗原,最终组装获得组装率90%以上的金纳米粒子三聚体,通过UV-vis以及圆二色光谱对其进行光学性质表征,组装后的金纳米粒子其紫外可见光吸收没有显著变化,但其在波长525 nm处产生显著的手性吸收信号。3、本文通过游离原肌球蛋白与金纳米粒子三聚体中金标原肌球蛋白竞争结合金标抗体的结合位点的方式定量检测样品中游离原肌球蛋白的含量,最终方法标准曲线回归方程y =-4.607 In(x)+ 17.251,相关系数R2=0.9927,线性范围为0-14ng·mL-1。方法的检出限(limit of detection,LOD)为 21 pg·mL-1(S/N=3),定量限(limit of quantitation,LOQ)为70pg·mL-1(S/N=10),相比起传统的ELISA的定量方法(LOD=90 pg·mL-1),金纳米三聚体生物传感器具有更高的灵敏度,并且极大的减少了检测时间。4、本文提取了中国对虾(Penaeus chinnsis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、北极甜虾(Pandallus boreali)、斑节对虾(Penaeus monodon)、虾姑(Oratosquillaoratoria)以及克氏原螯虾(Procambarus clarkia)在内的7种常见甲壳类水产品全蛋白浸提液,并通过金纳米粒子三聚体传感器与间接性ELISA对全蛋白浸提液中原肌球蛋白的含量进行定量分析。结果表明,两种分析方法检测结果相近,证明此方法具有较好的准确性。
【学位单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TP212.3;O657.1;TS254.7
【部分图文】：

２．３实验方法??２．３．１刀额新对虹原肌球蛋白体外表达载体质粒的构建??２．３．１．１试验菌株感受态制备??（１）?Ｓｔｂｌ３?￡■．＜：〇／／感受态菌株制备??取５０?｜ａＬ?Ｓｔｂ丨３?￡．？＞／／菌液用划线法接种于ＬＢ琼脂平板上，于３７?°Ｃ培养箱??中培养Ｉ６ｈ。取平板上单菌落于ＬＢ肉汤培养基中单克隆，于３７°Ｃ摇床中培养。??１６?ｈ后以菌液：ＬＢ肉汤培养基＝１：１００的比例将单克隆后菌液接入２００?ｍＬ新鲜??ＬＢ肉汤培养基中，于３７°Ｃ摇床中进行扩增（至ＯＤ＝０．２－０．５）。将扩增后菌液于??４?°Ｃ?３０００?ｇ离心丨０?ｍｉｎ，移去培养基，加入６０?ｍＬ预冷的０．１?ｍｏｌ．Ｌ－１氯化ｔ丐溶??２２??

在扩增过程中仍可能存在序列碱基突变、缺失或增加等影响最终蛋白表达结果的??因素，因此，将重组质粒进行测序（生工生物工程（上海）有限公司），其测序??结果与原设计序列对比如图２－５所示。??（６＾５）?ＢｓｓＨＩＩ?Ｔｓ〇Ｉ?（９１８）??（１４２）?Ｎｏｔｌ?（６３９）?ＰｆＩＦＩ?－?Ｔｔｈｌｌｌｌ?Ｈｉｎｄｉ?Ｈｐａｌ?（９３２）??（８４）?ＥｃｏＲＩ?（５２８）?ＦｓｐＩ?ＡｓｉＳＩ?（１００３）??（０）?Ｓｔａｒｔ?（２９９）?ＮｓｐＩ?（４４９）?ＡｃＩＩ?Ｅｎｄ?（１１００）??２５０＇?５００＇?７５０＇?１００Ｃ１??？?！■?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ＴＲＯＰ??Ｆａｃｔｏｒ?Ｘａ?ｓｉｔｅ??ＴＥＶ?ｓｉｔｅ?ＦＬＡＧ??图２－５重组质粒测序片段序列与设计序列对比图??Ｆｉｇ．?２－５?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ａｎｄ?ｄｅｓｉｇｎ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ??ｃｈａｒｔ??碱基的突变状况与对表达出氨基酸的影响如表２－１３所示，重组后的质粒在??测序段序列内第９５１和９５７两处碱基发生点突变，Ｍ终表达出的重组Ｋｉ肌球蛋Ａ??分别在２６８位氨基酸处由Ｌｙｓ突变为Ｇｉｎ、２７０位处氨基酸山ｌｉｅ突变为Ｌｅｕ，但??序列保守性仍达到了?９９．８％，Ｒ未出现因突变导致重组蛋白翻译终止，ＩＬ应用子??纯化、修饰、酶切的关键Ｔａｇ蛋白位点未发生突变

Ｆｉｇ．?２－７?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ??２．４．２．３重组蛋白浓度分析结果??通过ＢＣＡ法分析蛋白浓度，标准蛋白的标准曲线如图２－７所示，每个样品??重复３次，以标准蛋白浓度为Ｘ轴，吸光度Ａ５６２为Ｙ轴做标准蛋白浓度的标准??曲线。所得标注曲线ｙ＝ｌ．ｌ〇６６５ｘ＋０．１２５２５，相关系数Ｒ２＝０．９９９４６，纯化后的重组??刀额新对奸原肌球蛋白Ｗ量为丨．８４６０?ｍｇ＇ｍＬ＇１。??０?Ｓ＇ｌ?ｙ＝?１．１０６６５ｘ?＾０．１２５２５??Ａ?＇?Ｒ２＝０．９９９４６??０．６－?■??３?０．?５?－?■?Ｚ?’??Ｉ－?■??＾?ｏ．?３?－??〇，：??０．?１?－??ｏ．?ｏ?－Ｉ?■?１?？?１???１???１???１??０．０?０？〗?０＿?２?０．３?０．４?０．５??标准蛋內浓度）??图２－８蛋白质浓度标准曲线??Ｆｉｇ．?２－８?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??２．４
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本文编号：2858466