金枪鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽的分离鉴定及其作用机制初探

发布时间：2020-10-30 05:49

　　 高尿酸血症是指人体血尿酸水平长期处于过饱和状态所引起的一系列症状总称,是诱发系列健康问题重要因素之一。目前常用的降尿酸药物(如别嘌呤醇)由于具有显著依赖性与毒副作用,使得天然安全高效的降尿酸肽的研究和开发日趋升温。前期实验研究发现金枪鱼蛋白水解物(TPH)可显著抑制高尿酸血症大鼠血清中黄嘌呤氧化酶(XO)活性,从而降低其血尿酸水平。本文旨在明晰TPH中黄嘌呤氧化酶抑制肽构效关系及XO抑制作用机制。首先通过对比不同缓冲试剂对TPH体外XO抑制活性的影响,获得最优体外XO抑制率检测模型,结合多种分离手段从TPH中富集强XO抑制活性组分,并通过质谱联用技术鉴定其氨基酸序列;采用固相合成法获得目标XO抑制肽,综合XO抑制活性及其残基与XO相互作用特点,分析XO抑制肽的构效关系及其XO抑制作用分子机制,为XO抑制肽研究与降尿酸肽产品开发提供理论和方法的参考。(1)针对目前未考虑不同缓冲体系中离子类型及强度对多肽和酶构象的影响,而直接参考其它小分子抑制剂活性测定方法来测定多肽XO抑制率的问题。本论文对比探究了三种常用缓冲试剂对多肽XO抑制率测定结果的影响。结果表明TPH在三种缓冲液中未见明显结构变化,但缓冲液HEPES与XO和TPH会产生相互作用,降低XO的α-螺旋含量,使得酶结构更加松弛,从而导致TPH在HEPES体系中具有更高的XO抑制率,为评价缓冲试剂对体外天然大分子生物活性的影响研究提供了参考。(2)采用乙醇溶液和Sephadex G-15对TPH中XO抑制多肽进行高效分离。结果发现醇溶组分(ESF)的XO抑制活性最好,这可能与其中含有更多疏水性氨基酸残基和1 kDa的肽密切相关;采用体外XO抑制率为筛选指标,从Sphadex G-15 8个分离组分中确认P6组分活性最佳;并通过UPLC-Q-TOF-MS/MS从中鉴定出13条肽,其中FH的XO抑制活性最佳。同时对比本研究HPLC法和文献中使用的UV方法测定13条肽的XO抑制活性,发现UV法并不适用于测定包含Trp的肽。(3)利用分子对接方法探究了本研究鉴定的XO抑制肽与XO相互作用模式。首先归纳了已知抑制剂配体与XO的作用特点。通过XO抑制肽FH的抑制作用机制研究发现,FH可与底物竞争XO活性中心位点,并与XO活性中心Phe-914、Ser-876及Thr-1010残基之间存在相互作用,从而起到抑制XO活性作用。此外,Phe对肽的XO抑制活性至关重要,且碱性氨基酸能增强含Phe残基寡肽的XO抑制活性。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS254.4
【部分图文】：

图 1-2 黄嘌呤氧化酶结构简图Figure 1-2 The structure of Xanthine Oxidase抑制剂上主要应对高尿酸血症以及其引起的系列疾病减少血管氧化应激和血液中尿酸水平[19]。XO位点（包括抑制剂别嘌呤醇）[20]和 FAD 辅助机化合物，由稠合芳香族和咪唑组成的环状化嘌呤的相似程度可以将XO抑制剂分为嘌呤类布索坦和黄酮类化合物）[14,22,23]。为广泛的 XO 抑制剂类降尿酸药物是别嘌呤醇争性抑制剂，能够占据底物嘌呤在 XO 上的活

血管紧张素转换酶（ACE）抑制作用和抗菌作用）的优劣。ESF、TPH 和 EIF 的水性氨基酸含量与 XO 抑制活性存在一致性，因此可以判断 TPH 中部分疏水性氨基残基对其 XO 抑制活性可能具有一定贡献作用。由于 XO 的活性中心由疏水口袋组成该结构作为重要的结构域，是 XO 抑制剂发挥功能重要的区域。因此疏水性相对较强多肽更容易通过疏水相互作用进入 XO 活性中心发挥抑制功能。3.3.4 Sephadex G-15 分离与活性分析凝胶色谱柱是一种分子排阻色谱柱，能够将生物大分子样品按照分量大小顺序进洗脱分离。其中 Sephadex G-15 凝胶柱适用于分离分子量低于 1500 Da 的多肽。在本究中，Sephadex G-15 用于进一步分离纯化 ESF，分别获得了八个组分（按顺序标记P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7 和 P8，图 3-3a）。这八个组分的 XO 抑制率（测定浓度8 mg/mL）如图 3-3b 所示。其中 P6 具有最高的 XO 抑制率（67.5±2.8％），而 P7 组最低。

华南理工大学硕士学位论文以归纳出几个有关抑制剂配体与酶活性中心相互作用的重要信 XO 的 π-π 相互作用：所选取的 8 个抑制剂配体均能与 XO 活成错位面对面 π-π 堆积作用；其中 6-巯基嘌呤、LUZ、槲皮素还能够与 XO 活性中心的 Phe-1009 残基形成的边对面 π-π 堆积1009 分别位于配体大 π 键的两侧，如图 4-1 所示。因此，抑制的 Phe-914 残基形成 π-π 堆积作用对其展现 XO 抑制活性至关
【参考文献】

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本文编号：2862080