冷鲜牛肉特定腐败菌假单胞菌鉴定及肉桂醛对其抑制的研究

发布时间：2020-11-09 11:47

　　 牛肉是中国仅次于猪肉的第二大消耗肉品,2017年国内消费量达到789万吨,具有较好的行业前景。冷鲜肉能良好地保持肉品风味和营养价值,逐渐成为肉类消费的主流。冷鲜牛肉在冷链贮运中由于自溶酶和嗜冷微生物繁殖代谢不断积累醛、酮、胺、有机酸等物质,导致品质下降,甚至腐败变质。在肉品复杂的微生物菌群中,只有一种或几种特定微生物在腐败中起着主导作用,即特定腐败菌。植物提取物具有抗氧化活性、抑菌或杀菌活性,有利于提高食品的安全性,延长食品保质期。肉桂醛已被美国食品和药物管理局批准用于食品,它对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病性有良好的抗菌活性。目前牛肉在低温贮藏下品质研究主要集中在腐败菌鉴定,而冷链中牛肉微生物菌群结构和特定腐败菌的控制仍有待于研究。鉴于此,本研究采用培养依赖的16S rDNA结合非培养的高通量测序分析冷鲜牛肉在0℃下微生物菌群变化及优势腐败菌,评价其致腐和生物被膜形成能力,比较反式肉桂醛和顺式肉桂醛对特定腐败菌抑菌及抗生物被膜的活性,通过荧光定量PCR(RT-PCR)检测相关基因表达量的影响。研究为较全面了解冷鲜牛肉中微生物动态变化,探寻植物提取物抑制腐败菌,为高品质牛肉冷鲜技术的研发提供参考。主要结果如下:1、分析了牛肉冷藏过程中品质变化和微生物群落结构变化。牛肉冷藏中感官品质保持良好,18d有腐臭味,且TVB-N值和TBA值分别在15d、18d超过限值。而样品中菌落总数第3d快速上升,第9d菌落总数为6.75 1g cfu/g,之后呈现稳定趋势,CFC、STAA、VRBA和MRS中细菌增长与菌落总数趋势相似,其中假单胞菌增长最快,肠杆菌数和乳酸菌数增长最慢。牛肉的感官评分与理化指标和微生物指标、理化指标与菌落总数均存在显著相关性。培养依赖的16S rDNA测序发现,冷鲜牛肉贮藏初期细菌表现多样性,包括热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta,30.77%)、气单胞菌属(Aeromonasspp,23.08%)和不动杆菌属(Acinetobacter spp,15.38%)等7种细菌。而高通量测序显示样品初期有嗜冷杆菌属(Psychrobacter,34.78%)、假单胞菌属(Pseudomonas,22.64%)和乳杆菌属(Lactobacillus,12.21%)等9种细菌构成。而腐败终点细菌种类明显下降,两种鉴定方法均显示假单胞菌和热死环丝菌为优势菌。采用grB基因鉴定10株腐败假单胞菌分离株,发现莓实假单胞菌(P.fragi)占50%,其次为隆德假单胞菌(P.lundnsis,30%)和荧光假单胞菌(P.fuorescen,20%)。研究表明,冷鲜牛肉在0℃贮藏的货架期约为12d,假单胞菌是导致牛肉品质下降的优势致腐菌。2、评价假单胞菌、热死环丝菌和蜂房哈夫尼菌15株腐败分离株在无菌牛肉汁/牛肉的致腐性,采用结晶紫微孔板染色法、珠涡流法等分析腐败菌的生物被膜形成和粘附性特性。结果表明,牛肉汁平板筛选发现假单胞菌PS16、PS17和PS28对牛肉肌浆蛋白有较强的分解。腐败分离株28℃下在无菌牛肉汁中生长速率相近,其中蜂房哈夫尼菌细菌密度最高,假单胞菌次之,而0℃下假单胞菌生长较快。接种假单胞菌和蜂房哈夫尼菌的牛肉汁感官评分、pH值和TVB-N显著高于热死环丝菌,且假单胞菌PS26、PS20、PS16、PS27、PS28、PS29和PS30具有较强的蛋白酶活性,其中隆德假单胞菌PS28在牛肉汁中的致腐性最强。体外生物被膜分析显示,假单胞菌生物被膜形成强于其他两种致腐菌,热死环丝菌被膜形成微弱。在三个种属腐败菌中,假单胞菌具有较强的被膜形成能力,分泌较多的胞外分泌物和粘附量,其中隆德假单胞菌PS28、PS17和PS27能力较强。同时,培养温度也影响腐败菌的被膜形成,假单胞菌在0℃下生物被膜形成较慢,而成熟被膜为28℃的2.88～10.99倍。并且,假单胞菌PS17、PS27和PS28泳动性最强,而热死环丝菌和哈夫尼菌无泳动性。将筛选的强致腐株PS28、PS16和PS17进一步接种无菌牛肉,显示在0℃贮藏15d后PS28的感官评分和TVB-N值显著大于其他两株菌,腐败风味物质主要为乙酸乙酯。可见,肉源优势腐败菌中假单胞菌具有较强致腐能力,而假单胞菌分离株间的致腐性和被膜形成能力存在差异,其中隆德假单胞菌PS28为特定腐败菌。3、研究肉桂醛对特定腐败菌隆德假单胞菌PS28致腐性和生物被膜形成的抑制作用。反式肉桂醛和顺式肉桂醛均能抑制隆德假单胞菌的生长,最小抑菌浓度(MIC)分别为200和225 μg/mL。亚抑菌浓度1/8、1/4、1/2 MIC的反式肉桂醛分别降低32.88%、47.95%和60.27%被膜结晶量,而顺式肉桂醛分别减少26.03%、41.10%和52.05%。三种亚抑菌浓度的反式肉桂醛分别降低菌体在不锈钢片上30.82%,39.74%和56.35%的粘附量,而顺式肉桂醛仅1/2 MIC显著降低。共聚焦显微镜观察发现,反式肉桂醛和肉桂醛对隆德假单胞菌生物被膜的抑制作用呈现浓度依赖性,对照组、添加1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC反式肉桂醛被膜厚度分别为40.67μm、25.33μm、17.67μm和10.50μm,而添加相似浓度的顺式肉桂醛被膜厚度为25.52μm、18.67μm和14.000μm。肉桂醛能显著抑制隆德假单胞菌的泳动性(p0.05),其中1/2 MIC反式肉桂醛和顺式肉桂醛分别降低58.08%和42.29%。肉桂醛也能有效抑制菌体噬铁素的分泌,其中3个亚抑菌浓度的反式肉桂醛降低36.84%～73.68%相对含量,而顺式肉桂醛减少10.52%～63.16%。肉桂醛还能显著减少菌体胞外酶活性,其中1/8、1/4、1/2 MIC反式肉桂醛降低11.90%～61.90%蛋白酶活性和12.83%～40.17%脂肪酶活性,顺式肉桂醛蛋白酶活性减少28.60%～76.19%,脂肪酶活性降低18.80%～47.01%。RT-PCR检测结果表明,在反式肉桂醛和肉桂醛作用下,隆德假单胞菌5个靶基因粘附基因lapA、鞭毛基因fliC、噬铁素基因pvdH、蛋白酶基因aprX和脂肪酶基因lip表达量呈现显著降低,其中1/2 MIC反式肉桂醛和顺式肉桂醛lapA、fliC、PvdH、aprX和lip表达量分别降低至对照组的0.05、0.11、0.11、0.16、0.10 和 0.02、0.12、0.03、0.10、0.04 倍,仅1/8 MIC肉桂醛组粘附基因lapA无显著变化。可见,肉桂醛能有效减少隆德假单胞菌的生长、被膜形成和致腐酶,其中反式肉桂醛对菌体生物被膜形成和粘附性抑制效果更强,肉桂醛对腐败相关酶的抑制活性更强。可见,冷鲜牛肉贮藏过程中优势腐败菌是假单胞菌和热死环丝菌,其中隆德假单胞菌PS28为特定腐败菌,且有较强生物被膜形成能力,肉桂醛能够抑制PS28生物被膜形成能力、胞外酶活性及相关基因表达水平。
【学位单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS251.52
【部分图文】：

Ｆｉｇ．?３－２?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ，?Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ?ａｎｄ?Ｈａｆｎｉａ?ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ??ｂｅｅｆ?ｊｕｉｃｅ?ａｔ?２８?°Ｃ??研究测定１５株腐败菌分离株在２８°Ｃ下培养的生长曲线。如图３－２所示，腐??败菌在４?ｈ到１６?ｈ期间生长迅速，尤其是ＨＡ３９在对数生长期生长最快，假单胞??菌次之，且这９株假单胞菌的生长基本保持一致，热死环丝菌生长最慢。在１２?ｈ??后ＨＡ３９生长缓慢，培１２?ｈ进入稳定期；假单胞菌在１８?ｈ后生长减缓，培养１５??ｈ进入稳定期；而热死环丝菌依然在缓慢增长，在２１?ｈ进入稳定期。哈夫尼菌和??假单胞菌在稳定期的细菌量达到约９?ｌｇｃｆｕ／ｇ，热死环丝菌的菌量最少，大致达到??７．５?ｌｇ?ｃｆｕ／ｇ。??？Ｊ－，ｒ?－?－?９－ｊｒ?????Ａ?署－ＢＴ７?Ｂ?ＰＳＩ６￣＊￣?ＰＳＩ７??？?－＾－ＢＴ８?．?－?－Ａ－ＰＳ１８－Ｔ－ＰＳ１９??－Ａ－０Ｔ９?＾?ＰＳ２０－４—?ＰＳ２６?鮝??８＿」ｒ－ＢＴ１０?８＂?ＰＳ２７－＾?ＰＳ２８?１??．１?ＨＡ３９）?－ｈ？－ＰＳ２９￣＃－ＰＳ３０??？１Ｈ?｜?１?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?＇?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?１??０?２?４?６?Ｋ?０?２?４?６?Ｘ??吋间／ｄ?时间／ｄ??图３－３热死环丝菌、假单胞菌和哈夫尼菌在０°Ｃ下的生长曲线??Ｆｉｇ．３－３Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ

??同时１５株腐败菌分离株在０°Ｃ下培养的生长曲线，如图３－３所示。腐败菌在??Ｏｄ到５ｄ期间生长迅速，假单胞菌、热死环丝菌与哈夫尼细菌生长规律基本相似。??ＨＡ３９在５ｄ后生长缓慢，培养６ｄ进入稳定期；假单胞菌在４ｄ后生长缓慢，培??养５ｄ进入稳定期；而热死环丝菌依然在逐渐增长，在７ｄ进入稳定期。哈夫尼菌??以及热死环丝菌在稳定期的细菌量大致达到８．１?Ｉｇｃｆｕ／ｇ，假单胞菌的菌量最少，??约为?７．３１ｇ?ｃｆｕ／ｇ。??３．４．３三类优势菌在牛肉汁中的感官评分??１０?－ｊ?ｎ?１??二｜６ｄ?ａ??■?＇ＭｌＳｄｌ?咹?ａｂ?ａＴｂ??ａｂ?Ｔ??８－?ｈ?ｕ?Ｔ??ｂ?ｆ?１?２?＾?？?ｂ??６－?ｔ?［?ｂ??％?－?Ｍ?ｉ?ｃ?ｒ?ｃ「．?１??２：身??图３－４热死环丝菌、假单胞菌和哈夫尼菌在ｏ°ｃ牛肉汁中的感官评分??Ｆｉｇ．３－４?Ｓｅｎｓｏｒｙ?ｓｃｏｒｅ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ，?Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ?ａｎｄ／／ｑ／ｗ／＾ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ?ｂｅｅｆ??ｊｕｉｃｅ?ｓｔｏｒｅｄ?ａｔ?０°Ｃ??感官评定是评价肉制品品质的重要指标，因微生物生长繁殖过程中利用肉类??蛋白质等营养物质，逐步积累代谢降解产物，导致牛肉汁出现浑浊、散发酸臭味??和硫化氢味等腐败变质现象。如图３－４所示

牛肉冷藏期间ＴＶＢ－Ｎ的累积是由于在微生物和酶的作用下，引起蛋白质的??脱氨、脱羧作用，降解产生氨及胺类等挥发性的碱性含氮物质，是评价肉质新鲜??度最重要的指标。从图３－７可知，无菌牛肉汁初期ＴＶＢ－Ｎ值为５．２５?ｍｇ?Ｎｎ００?ｍＬ，??且在０°Ｃ冷藏中变化微弱（Ｐ＞０．０５）。接种热死环丝菌组、假单胞菌组和蜂房哈??夫尼菌组在冷藏第６ｄＴＶＢ－Ｎ值分别为６．３０－７．００、５．６０？１０．８５和７．００?ｍｇ?Ｎｎ〇０??ｍＬ。在冷藏第１５ｄ热死环丝菌组中ＴＶＢ－Ｎ值上升至８．２３？８．５８?ｍｇ?Ｎ／１００?ｍＬ，??假单胞菌组中除ＰＳ１６和ＰＳ３０外，其余接种牛肉汁ＴＶＢ－Ｎ值上升至８．２３￣１５．２３??ｍｇＮ／１００ｍＬ（ｐ＜０．０５），其中ＰＳ２８菌株上升最快（ｐ＜０．０５）；而接种蜂房哈夫尼??菌牛肉汁的ＴＶＢ－Ｎ值达到８．２３ｍｇ?Ｎ／１００?ｍＬ。??ｌｓ１ｉｒ?￣Ｉｍ?１?ａ??丨４：祖以！??３１２－?ｄ??Ｉ?＇?ｂ?ｒ?ａｊ?Ｊ｜??｜?１０－?ｐ?ｆ?ｒ?ｅ?ｃ??１?￡?ｆ?ｆ?ｆ?＾?ｆ?ｅ￡?ｆ??５?ｓ－??滅?ｆａ?ｆ?ｆ?ｆ?ｆ??？?Ｉ?草?ｒ?ｐ?「?ｈ?「??＾?６－?．ｇ?＾??ｓ?■?ｎ??＾４－１??６?］?Ｉ??图３－７热死环丝菌、假单胞菌和哈夫尼菌在ｏｒ牛肉汁中的ＴＶＢ－Ｎ值变化??Ｆｉｇ．３－７?Ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆＴＶＢ－Ｎ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ
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本文编号：2876382