基于杂交链式反应的荧光信号放大策略在沙门氏菌检测中应用的研究
发布时间：2020-12-30 18:58
沙门氏菌（Salmonella）是一种广泛存在于肉类、牛奶、鸡蛋和蔬菜等食品中的食源性致病菌,该菌被欧洲疾病预防与控制中心列为世界上第二大的食物中毒元凶,现已被报道的Salmonella有2500多种血清型,其感染人类症状表现为恶心呕吐、腹痛腹泻、头痛发热等,建立快速灵敏的检测方法实现对该菌的有效监控具有重要意义。基于杂交链式反应（Hybridization chain reaction,HCR）的荧光信号放大方法因操作简单、特异性强、灵敏度高,受到研究者们的广泛关注。本研究构建了基于HCR的荧光生物传感器,实现了对食品中Salmonella快速灵敏的检测,为我国食源性致病菌的监测体系提供了新的技术手段。各章内容分述如下:第一章综述了核酸杂交介导的荧光信号放大方法在生物检测中应用的研究进展。第二章建立了两种基于HCR和磁珠的新方法用于检测Salmonella,该方法通过生物素标记的DNA探针（bio-probe）将不对称聚合酶链式反应（Asymmetry polymerase chain reaction,aPCR）获得的目标单链DNA（Single stranded DNA,ssDN...
【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
几种HCR介导的荧光信号放大方法
方法提取细菌 DNA，并将其作为模板按照 2.3.4 所示方法进行 aPCR。（4）按照 2.3.10.2 检测方法进行实验，最后通过酶标仪进行荧光分析。4结果与讨论.1引物浓度优化结果aPCR 是利用不等量的上下游引物进行 PCR 扩增，从而获得大量特定 ssDNA技术，其中上下游引物浓度比例为影响 ssDNA 产量的重要因素，因此本实验上下游引物浓度比进行了优化，优化结果如图 2-1。图 2-1 分别显示了上下游物浓度比为 1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、10:1、20:1、30:1、40:1 时的 aPCR果，其中每个实验组固定非限制性引物浓度为 1.2 μM，从图中可以看出，当游引物作为非限制性引物时，ssDNA 片段更清晰，而当上下游引物浓度比为:1 时，ssDNA 条带最亮，因此选择 10:1 作为最佳上下游引物浓度比，即上下引物浓度分别为 1.2 μM 和 0.12 μM。
图 2.3 HCR 可行性验证Figure 2.3 The feasibility verification of HCR HCR结合磁珠的荧光修饰法检测Salmonella.1实验原理HCR 结合磁珠的荧光修饰法原理图如图 2.4。该实验根据 Salmonella 的序列设计一对特异性引物，并通过控制 aPCR 过程中上下游引物浓度菌存在情况下产生大量特定序列的 ssDNA。通过 NUPACK 软件对 s级结构进行模拟，选取 ssDNA 上无自身折叠的末端序列为引发链，设发生 HCR 反应的 DNA 发夹探针，以及与 ssDNA 另一末端序列互补配robe。该实验具体步骤可分为以下五步：（1）通过链霉亲和素（Strepta与生物素（biotin, bio）的亲和作用，将 bio-probe 固定于 SA-MBs 表面A-MBs~bio-probe 复合物；（2）ssDNA 通过与 bio-probe 结合被固
【参考文献】：
期刊论文
[1]荧光法在食品理化检验标准中的应用进展[J]. 徐静,孙兴权,韩慧,王丹,李妍,刁文婷,曹际娟. 食品安全质量检测学报. 2015(01)
[2]食品中金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的研究[J]. 徐晓可,吴清平,张菊梅,周艳红,杨小鹃. 食品与生物技术学报. 2011(01)
[3]荧光标记染料[J]. 杨祥宇,宋健,冯荣秀. 化学通报. 2003(09)
博士论文
[1]用于重金属离子检测的电化学传感器研究[D]. 陈晨.华东理工大学 2013
硕士论文
[1]发夹型DNA荧光探针设计新方法研究[D]. 周文玉.湖南大学 2011
本文编号：2948136
【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
几种HCR介导的荧光信号放大方法
方法提取细菌 DNA，并将其作为模板按照 2.3.4 所示方法进行 aPCR。（4）按照 2.3.10.2 检测方法进行实验，最后通过酶标仪进行荧光分析。4结果与讨论.1引物浓度优化结果aPCR 是利用不等量的上下游引物进行 PCR 扩增，从而获得大量特定 ssDNA技术，其中上下游引物浓度比例为影响 ssDNA 产量的重要因素，因此本实验上下游引物浓度比进行了优化，优化结果如图 2-1。图 2-1 分别显示了上下游物浓度比为 1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、10:1、20:1、30:1、40:1 时的 aPCR果，其中每个实验组固定非限制性引物浓度为 1.2 μM，从图中可以看出，当游引物作为非限制性引物时，ssDNA 片段更清晰，而当上下游引物浓度比为:1 时，ssDNA 条带最亮，因此选择 10:1 作为最佳上下游引物浓度比，即上下引物浓度分别为 1.2 μM 和 0.12 μM。
图 2.3 HCR 可行性验证Figure 2.3 The feasibility verification of HCR HCR结合磁珠的荧光修饰法检测Salmonella.1实验原理HCR 结合磁珠的荧光修饰法原理图如图 2.4。该实验根据 Salmonella 的序列设计一对特异性引物，并通过控制 aPCR 过程中上下游引物浓度菌存在情况下产生大量特定序列的 ssDNA。通过 NUPACK 软件对 s级结构进行模拟，选取 ssDNA 上无自身折叠的末端序列为引发链，设发生 HCR 反应的 DNA 发夹探针，以及与 ssDNA 另一末端序列互补配robe。该实验具体步骤可分为以下五步：（1）通过链霉亲和素（Strepta与生物素（biotin, bio）的亲和作用，将 bio-probe 固定于 SA-MBs 表面A-MBs~bio-probe 复合物；（2）ssDNA 通过与 bio-probe 结合被固
【参考文献】：
期刊论文
[1]荧光法在食品理化检验标准中的应用进展[J]. 徐静,孙兴权,韩慧,王丹,李妍,刁文婷,曹际娟. 食品安全质量检测学报. 2015(01)
[2]食品中金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的研究[J]. 徐晓可,吴清平,张菊梅,周艳红,杨小鹃. 食品与生物技术学报. 2011(01)
[3]荧光标记染料[J]. 杨祥宇,宋健,冯荣秀. 化学通报. 2003(09)
博士论文
[1]用于重金属离子检测的电化学传感器研究[D]. 陈晨.华东理工大学 2013
硕士论文
[1]发夹型DNA荧光探针设计新方法研究[D]. 周文玉.湖南大学 2011
本文编号：2948136
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