黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚体制备及性质研究
发布时间：2021-01-05 12:10
脂肪酶是一种极具商业价值的丝氨酸水解酶类,可用于食品、医药、化工等行业。但大多数天然脂肪酶都存在稳定性差、易变性失活以及不可回收利用等缺点,这导致脂肪酶的应用受到限制。因此,本研究采用来自于黑曲霉GZUF36的胞外脂肪酶（extracellular lipase from Aspergillus niger GZUF36,ANL）进行交联酶聚集体（Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs）制备,以获得酶活力高、稳定性强且可多次回收利用的固定化脂肪酶。此外,通过对黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚集体（CLEAs-ANL）酶学性质、二级结构、形态外貌以及选择性进行研究,为后续该酶在功能性油脂的合成以及工业化大规模应用提供参考依据和理论基础。主要内容和结果如下:（1）当叔丁醇与粗酶液体积为4:1,交联剂添加量为30μl,交联时间为1.5小时,离心转数为6000 r/min时为制备CLEAs-ANL的最佳条件。在该条件下,CLEAs-ANL酶活回收率为100.3±1.1%,酶活力可达13.8±0.51 u/ml。研究了不同添加剂如BSA、BSA水解产物、油酸...
【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CO2分散反胶束溶液制备交联酶聚集体（CLEAs）的TEM照片(Chenetal.,2006)
C3键处被特异性切割，形成两个反应性醛基。这些生成的二醛基团对赖氨酸残基中的氨基特别活泼，可形成席夫碱，从而替代GLA成为一种可再生且无毒的交联剂(Nadar et al., 2016)。如图1.3所示，一些温和的交联剂如乙二醇-双[琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺]（EG-NHS）可以取代GLA用于青霉菌脂肪酶CLEAs的制备，该交联剂主要通过N-羟基琥珀酰亚胺酯形成稳定的酰胺键来交联蛋白质，制得的EG-NHS聚集体较用戊二醛制备的CLEAs具有更优异的水解和酯化活性(Rehmanet al., 2016)。有研究(Mileti et al., 2009)表明CAL-B的热稳定性对双环氧化物的交联度及链长度具有很强的依赖性。苯醌也被报道用作交联剂，且制得的CLEAs在50℃孵育90 min后的热稳定性比用GLA制备的CLEAs高5倍(Wang et al., 2011)。对于一些酶而言，小分子的交联剂可能会进入蛋白质内部破坏它们的三级结构，导致酶活性完全丧失。此外，不少研究还致力于开发葡聚糖和壳聚糖等大分子作交联剂来制备CLEAs(Panwar et al., 2017)。
本研究选取了盐（饱和的硫酸铵）、有机溶剂（叔丁醇、丙酮）、聚合物（聚乙烯醇）三种不同类型的沉淀剂制备CLEAs-ANL以研究它们对其活力的影响，结果如图2.1所示。当使用聚乙烯醇做沉淀剂时，酶活回收率显著下降，这可能是由于聚乙烯醇不能使酶很好的沉降下来所导致，因为在不加交联剂的情况下，使用聚乙烯醇沉淀脂肪酶只观察到少量沉淀物，且上清中仍能检测到部分酶活。而使用饱和的硫酸铵做沉淀剂时，酶活回收率达到59.3±1.2%，但用硫酸铵做沉淀剂制备的CLEAs在水溶液中可能会产生溶解现象(张晶晶，2012)；相比之下，使用叔丁醇和丙酮做沉淀剂都可得到较好的结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]反胶束体系中脂肪酶催化合成单月桂酸甘油酯[J]. 张桂菊,王肖彦,王瑞,陈芳莉,徐宝财. 中国油脂. 2019(01)
[2]复合交联酶聚集体的制备及催化羰基不对称还原合成手性醇[J]. 杨猛,江惠娟,宁晨曦,魏东芝,苏二正. 高等学校化学学报. 2018(01)
[3]具有菲环骨架的高分子载体固定淀粉酶交联聚集体[J]. 黎克纯,卢建芳,周菊英,许海棠,赵彦芝. 食品科学. 2017(14)
[4]以大孔硅胶为载体的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备及性质研究[J]. 李连连,崔建东. 食品工业科技. 2014(11)
[5]牛血清白蛋白辅助交联对苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体影响的研究[J]. 孙立梅,李连连,崔建东. 食品工业科技. 2013(13)
[6]脂肪酶及其在饲料中的应用[J]. 刘德海,解复红,贾彬,陈国参,权淑静,马焕. 中国饲料. 2012(16)
[7]交联酶聚体制备的研究进展[J]. 张思,张亚楠,崔建东. 中国酿造. 2010(08)
[8]CTAB混合反胶团萃取工业脂肪酶[J]. 沈睿,刘俊果,邢建民,刘会洲. 过程工程学报. 2005(03)
博士论文
[1]原料奶中荧光假单胞菌耐热性脂肪酶周质表达及酶学特性研究[D]. 张维清.中国农业科学院 2018
[2]新型交联酶聚体技术及其在蛋白组学与生物催化中的应用[D]. 王梦凡.天津大学 2011
[3]氨基酰化酶交联聚集体的制备及其催化性能研究[D]. 董涛.天津大学 2010
[4]黑曲霉脂肪酶的酶学性质、基因克隆与表达及结构预测[D]. 舒正玉.华中科技大学 2007
硕士论文
[1]脂肪酶交联聚集体的制备及其催化合成月桂酸淀粉酯[D]. 陈海龙.江南大学 2017
[2]反胶束法分离提纯黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶及其酶学性质研究、酶的固定化[D]. 张富豪.贵州大学 2017
[3]磁性纳米交联酶聚集体的制备及其在微管式反应器中的应用[D]. 郑德兵.北京化工大学 2017
[4]脂肪酶Candidia sp.99-125催化合成类可可脂工艺研究[D]. 刘墨砚.北京化工大学 2016
[5]嗜冷杆菌低温脂肪酶分离纯化及表征[D]. 张悦.大连理工大学 2015
[6]非水相介质中微生物脂肪酶法高选择性合成1,3-甘油二酯的研究[D]. 周换景.贵州大学 2014
[7]交联脂肪酶聚集体体系构建及其性质研究[D]. 董守利.华南理工大学 2013
[8]三种碱性脂肪酶水解活性预测及构效关系和洗涤性能研究[D]. 王孝杰.天津科技大学 2013
[9]交联脂肪酶聚集体（CLEAs）的制备及其粒径影响因素研究[D]. 张晶晶.北京化工大学 2012
[10]粗状假丝酵母脂肪酶的分离纯化水解乳脂的研究[D]. 董恒涛.华南理工大学 2010
本文编号：2958639
【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CO2分散反胶束溶液制备交联酶聚集体（CLEAs）的TEM照片(Chenetal.,2006)
C3键处被特异性切割，形成两个反应性醛基。这些生成的二醛基团对赖氨酸残基中的氨基特别活泼，可形成席夫碱，从而替代GLA成为一种可再生且无毒的交联剂(Nadar et al., 2016)。如图1.3所示，一些温和的交联剂如乙二醇-双[琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺]（EG-NHS）可以取代GLA用于青霉菌脂肪酶CLEAs的制备，该交联剂主要通过N-羟基琥珀酰亚胺酯形成稳定的酰胺键来交联蛋白质，制得的EG-NHS聚集体较用戊二醛制备的CLEAs具有更优异的水解和酯化活性(Rehmanet al., 2016)。有研究(Mileti et al., 2009)表明CAL-B的热稳定性对双环氧化物的交联度及链长度具有很强的依赖性。苯醌也被报道用作交联剂，且制得的CLEAs在50℃孵育90 min后的热稳定性比用GLA制备的CLEAs高5倍(Wang et al., 2011)。对于一些酶而言，小分子的交联剂可能会进入蛋白质内部破坏它们的三级结构，导致酶活性完全丧失。此外，不少研究还致力于开发葡聚糖和壳聚糖等大分子作交联剂来制备CLEAs(Panwar et al., 2017)。
本研究选取了盐（饱和的硫酸铵）、有机溶剂（叔丁醇、丙酮）、聚合物（聚乙烯醇）三种不同类型的沉淀剂制备CLEAs-ANL以研究它们对其活力的影响，结果如图2.1所示。当使用聚乙烯醇做沉淀剂时，酶活回收率显著下降，这可能是由于聚乙烯醇不能使酶很好的沉降下来所导致，因为在不加交联剂的情况下，使用聚乙烯醇沉淀脂肪酶只观察到少量沉淀物，且上清中仍能检测到部分酶活。而使用饱和的硫酸铵做沉淀剂时，酶活回收率达到59.3±1.2%，但用硫酸铵做沉淀剂制备的CLEAs在水溶液中可能会产生溶解现象(张晶晶，2012)；相比之下，使用叔丁醇和丙酮做沉淀剂都可得到较好的结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]反胶束体系中脂肪酶催化合成单月桂酸甘油酯[J]. 张桂菊,王肖彦,王瑞,陈芳莉,徐宝财. 中国油脂. 2019(01)
[2]复合交联酶聚集体的制备及催化羰基不对称还原合成手性醇[J]. 杨猛,江惠娟,宁晨曦,魏东芝,苏二正. 高等学校化学学报. 2018(01)
[3]具有菲环骨架的高分子载体固定淀粉酶交联聚集体[J]. 黎克纯,卢建芳,周菊英,许海棠,赵彦芝. 食品科学. 2017(14)
[4]以大孔硅胶为载体的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备及性质研究[J]. 李连连,崔建东. 食品工业科技. 2014(11)
[5]牛血清白蛋白辅助交联对苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体影响的研究[J]. 孙立梅,李连连,崔建东. 食品工业科技. 2013(13)
[6]脂肪酶及其在饲料中的应用[J]. 刘德海,解复红,贾彬,陈国参,权淑静,马焕. 中国饲料. 2012(16)
[7]交联酶聚体制备的研究进展[J]. 张思,张亚楠,崔建东. 中国酿造. 2010(08)
[8]CTAB混合反胶团萃取工业脂肪酶[J]. 沈睿,刘俊果,邢建民,刘会洲. 过程工程学报. 2005(03)
博士论文
[1]原料奶中荧光假单胞菌耐热性脂肪酶周质表达及酶学特性研究[D]. 张维清.中国农业科学院 2018
[2]新型交联酶聚体技术及其在蛋白组学与生物催化中的应用[D]. 王梦凡.天津大学 2011
[3]氨基酰化酶交联聚集体的制备及其催化性能研究[D]. 董涛.天津大学 2010
[4]黑曲霉脂肪酶的酶学性质、基因克隆与表达及结构预测[D]. 舒正玉.华中科技大学 2007
硕士论文
[1]脂肪酶交联聚集体的制备及其催化合成月桂酸淀粉酯[D]. 陈海龙.江南大学 2017
[2]反胶束法分离提纯黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶及其酶学性质研究、酶的固定化[D]. 张富豪.贵州大学 2017
[3]磁性纳米交联酶聚集体的制备及其在微管式反应器中的应用[D]. 郑德兵.北京化工大学 2017
[4]脂肪酶Candidia sp.99-125催化合成类可可脂工艺研究[D]. 刘墨砚.北京化工大学 2016
[5]嗜冷杆菌低温脂肪酶分离纯化及表征[D]. 张悦.大连理工大学 2015
[6]非水相介质中微生物脂肪酶法高选择性合成1,3-甘油二酯的研究[D]. 周换景.贵州大学 2014
[7]交联脂肪酶聚集体体系构建及其性质研究[D]. 董守利.华南理工大学 2013
[8]三种碱性脂肪酶水解活性预测及构效关系和洗涤性能研究[D]. 王孝杰.天津科技大学 2013
[9]交联脂肪酶聚集体（CLEAs）的制备及其粒径影响因素研究[D]. 张晶晶.北京化工大学 2012
[10]粗状假丝酵母脂肪酶的分离纯化水解乳脂的研究[D]. 董恒涛.华南理工大学 2010
本文编号：2958639
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